膜片鉗電生理技術的樣本種類:從較早的肌細胞、神經元和內分泌細胞發展到血細胞、肝細胞、耳蝸毛細胞、胃壁細胞、上皮細胞、內皮細胞、免疫細胞、精母細胞等多種細胞;從急性分散細胞和培養細胞發展到組織片乃至整體動物;從蝸牛、青蛙、蠑螈、爪蟾母細胞發展到雞細胞、大鼠細胞、人細胞等;從動物細胞發展到細菌及植物細胞。此外,膜片鉗技術還普遍地應用到平面雙分子層(planarbilayer)、脂質體(liposome)等人工標本上。研究對象:從對離子通道(配體門控性離子通道、電壓門控性離子通道、第二信使介導的離子通道、機械敏感性離子通道及縫隙連接通道等)的研究發展到對離子泵、交換體及可興奮細胞的胞吞、胞吐機制的研究等。膜片鉗電極已不單單是傳統意義上的電信號記錄電極,它還可作為其他研究方法的工具使用,如用于進行單細胞PCR技術時的細胞內容物抽吸。膜片鉗在通道研究中的重要作用:利用膜片鉗技術還可以用于藥物在其靶受體上作用位點的分析。東莞細胞生物學膜片鉗電生理技術方案
膜片鉗電生理技術的基本原理:膜片鉗技術用特制的玻璃微吸管吸附于細胞表面,使之形成10~100MΩ的高阻封接,被孤立的小膜片面積為微米數量級,因此封接范圍內細胞膜只有少數離子通道。然后對該膜片實行電壓鉗位,測量單個離子通道開放產生的微小電流,這種通道的開放是一種隨機過程。通過觀測單個通道開放的電流幅值分布、開放概率、開放壽命分布等功能參數,并分析它們與膜電位、離子濃度等之間的關系。將該部分細胞采用負壓吸破,可以形成較常見的全細胞記錄模式,可以研究整個細胞的生理功能和離子通道電生理功能。更進一步,還可以把吸管吸附放膜片從細胞膜上分離出來,以膜的外側向外或膜的內側向外等方式進行實驗研究。這種技術對膜內外溶液成分及施加藥物操作都很方便。東莞細胞生物學膜片鉗電生理技術方案全自動膜片鉗系統技術指標:操作簡單,全過程可自動化。
膜片鉗使用操作流程及注意事項:1.實驗結束后必須關閉實驗室的水電,檢查實驗室門窗。2.凡是在本平臺使用儀器的同學必須履行實驗室相關要求,完成值日等相關工作(值日生按照實驗室統一所發值日生要求履職)。3.在儀器使用以前及使用之后按按照使用時長做好登記工作。4.拉制儀提前預熱(至少30min)。且用完及時關閉。電熱加熱線溫度很高,在使用時注意避免燙傷。4.電腦里面的軟件不得隨意刪改,不得在本機電腦下載別的軟件,拷數據時需用實驗室配置的U盤。5.禁止私拉電線,如有實驗要求可與老師及時溝通。膜片鉗技術用特制的玻璃微吸管吸附于細胞表面,使之形成10~100MΩ的高阻封接,被孤立的小膜片面積為微米數量級,因此封接范圍內細胞膜光有少數離子通道。
膜片鉗記錄的幾種形式:內面向外膜片(inside-out patch) 高阻封接形成后,在將微管電極輕輕提起,使其與細胞分離,電極端形成密封小泡,在空氣中短暫暴露幾秒鐘后,小泡破裂再回到溶液中就得到“內面向外”膜片。此時膜片兩側的膜電位由固定電位和電壓脈沖控制。浴槽電位是地電位,膜電位等于玻管電位的負值。如放大器的電流監視器輸出是非反向的,則輸出將與膜電流(Im)的負值相等。外面向外膜片(out-side patch) 高阻封接形成后,繼續以負壓抽吸,膜片破裂再將玻管慢慢地從細胞表面垂直地提起,斷端游離部分自行融合成脂質雙層,此時高阻封接仍然存在。而膜外側面接觸浴槽液。膜片鉗技術的應用范圍:對離子通道生理與病理作用機制的研究。
膜片鉗技術之全細胞式與細胞吸附式的區別:全細胞式記錄這個名字乍聽上去好像和細胞吸附式沒啥兩樣,無非就是把電極戳在細胞上然后記錄它的電活動。但事實是,這兩者存在天壤之別。首先的一大區別體現在外部構型上:在cell-attached的記錄中,我們不需要用電極戳破細胞膜,只需將其懟在細胞膜上即可;但在whole-cell的記錄中,我們不只要將電極懟進細胞膜內,而且還不能懟得過深或過淺,否則你就無法記錄到有用的電信號。概括一下就是,要形成全細胞記錄必須打破細胞膜,但由于這個操作比較厲害,所以要破膜時請相信玄學。其次,第二大區別在電阻補償上:在cell-attached的記錄中,由于我們無需打通細胞內外膜,因此細胞膜上的各種離子通道或蛋白質就沒有串聯在電路當中,但是在whole-cell中,串聯電阻(Rs)就存在了,因此軟件輸出的命令電壓也就不等于細胞的跨膜電位,故我們需要對其進行補償。這些注意事項包括:電極電容及細胞膜電容補償問題,漏電流問題,液接電位的校正問題,空間鉗位問題,細胞內容物被電擊內液稀釋問題,電極內液的成分問題等。膜片鉗的數據如何處理:通過滲透很快改變胞漿成分并達到平衡。東莞細胞生物學膜片鉗電生理技術方案
膜片鉗技術可用于研究特殊制備的巨型球狀體中的細菌離子通道。東莞細胞生物學膜片鉗電生理技術方案
膜片鉗技術的基本原理和方法:膜片鉗使用的基本方法是,把經過加熱拋光的玻璃微電極在液壓推進器的操縱下,與清潔處理過的細胞膜形成高阻抗封接,導致電極內膜片與電極外的膜在電學上和化學上隔離起來,由于電性能隔離與微電極的相對低電阻(1~5MΩ),只要對微電極施以電壓就能對膜片進行鉗制,從微電極引出的微小離子電流通過高分辨、低噪聲、高保真的電流-電壓轉換放大器輸送至電子計算機進行分析處理。膜片鉗技術實現的關鍵是建立高阻抗封接,并能通過特定的記錄儀器反映這些變化。膜片鉗技術用特制的玻璃微吸管吸附于細胞表面,使之形成10~100MΩ的高阻封接。東莞細胞生物學膜片鉗電生理技術方案
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