Real-time PCR鏈式反應的常見問題：靶序列變異：如靶序列發生突變或缺失，影響引物與模板特異性結合，或因靶序列某段缺失使引物與模板失去互補序列，其PCR擴增是不會成功的。假陽性：出現的PCR擴增條帶與目的靶序列條帶一致，有時其條帶更整齊，亮度更高。引物設計不合適：選擇的擴增序列與非目的擴增序列有同源性，因而在進行PCR擴增時，擴增出的PCR產物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現假陽性。需重新設計引物。出現片狀拖帶或涂抹帶：PCR擴增有時出現涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過多或酶的質量差，dNTP濃度過高，Mg2+濃度過高，退火溫度過低，循環次數過多引起。其對策有：減少酶量，或調換另一來源的酶。②減少dNTP的濃度。適當降低Mg2+濃度。增加模板量，減少循環次數。聚合酶鏈式反應準備：PCR所用的酶主要有兩種來源：Taq和Pfu，分別來自兩種不同的噬熱菌。實時熒光定量PCR是一種采用外標準曲線定量的方法。武漢組織RT-PCR檢測技術方案

Real-time PCR：基線（baseline)：通常是3－15個循環的熒光信號，同一次反應中針對不同的基因需單獨設置基線。閾值（threshold)：自動設置是3-15個循環的熒光信號的標準偏差的10倍。手動設置：置于指數擴增期，剛好可以清楚地看到熒光信號明顯增強。同一次反應中針對不同的基因可單獨設置閾值，但對于同一個基因擴增一定要用同一個閾值。Ct值：與起始濃度的對數成線性關系，分析定量時候一般取Ct:15-35.太大或者太小都會導致定量的不準確。相對定量：通過與內參基因Ct值之間的相差來計算基因之間的表達差異,一般是2-△△Ct。或者是考慮擴增效率的Pfaffl法。武漢組織RT-PCR檢測技術方案聚合酶鏈反應的這種能力增強了許多方法，例如生成雜交探針用于雜交。

引物的設計對于這個實驗至關重要，因為Real-time PCR的檢測靈敏度比較高，所以相應的對引物設計的要求就很高。普通的要求規則大家都知道，還有幾點必須注意：1，引物的錯配率（引物錯配形成引物二聚體，但是SYBR照樣能嵌入進去，結果導致實驗結果的誤差很大，重復性也不好）。2，引物的特異性一定要高（不像常規PCR，引物同源性不高，只要兩條產物的片段長度相差足夠大，在電泳的時候能夠區分開就可以。Real-time PCR只有在熔解曲線的時候能分開，所以這就造成整個實驗結果誤差很大，不可信）。

Real-time PCR相對定量中的標準曲線法如何進行：主要是相對定量標準品的制作，一般有三種方法：1、比較復雜的方法：質粒，采用Biotnt提供內參基因的特異性Real-time PCRmRNA引物，對目的基因進行Real-time PCR實驗，得到PCR擴增產物；PCR擴增產物轉入質粒中，得到相對定量的標準品；2、一般采用的方法1：比較強的CDNA模板，3、一般采用的方法：PCR擴增產物，如果在方法2中找不到比較強的CDNA模板，則選用PCR產物作為相對定量的標準品也是可以的；需要注意的事項是：PCR產物濃度很高，而Real-time PCR的產物片段比較短，容易在稀釋的過程中造成PCR污染，要注意操作。Real-time PCR在實驗過程中為了防止非特異性擴增，必須設陰性對照。

Real-time PCR鏈反應的常見問題分析與解決方法：反應緩沖液未完全融化或未充分混勻。確保反應緩沖液融化完全并徹底混勻。引物特異性差。利用BLAST檢查引物特異性或重新設計引物。引物量過多。減少反應體系中引物的用量。模板量過多。質粒DNA的用量應<50ng，而基因組DNA則應<200ng。外源DNA污染。確保操作的潔凈。陰性對照出現條帶：試劑，頭，工作臺污染。使用全新的試劑和頭，對工作臺進行清潔。條帶大小與理論不符：污染。使用全新的試劑和頭，對工作臺進行清潔。模板或引物使用錯誤。更換引物和模板。基因亞型。對研究的基因進行序列分析和BLAST研究。逆轉錄-聚合酶鏈反應較廣用于表達譜，以確定基因的表達或鑒定RNA轉錄物的序列。在PCR產物中，由于內標與靶模板的長度不同。武漢組織RT-PCR檢測技術方案

Real-time PCR與普通PCR的實驗目的不同，所以對引物的設計要求也不同。武漢組織RT-PCR檢測技術方案

聚合酶鏈式反應（PCR）是一種用于放大擴增特定的DN段的分子生物學技術，它可看作是生物體外的特殊DNA復制，PCR的很大特點是能將微量的DNA大幅增加。因此，無論是化石中的古生物、歷史人物的殘骸，還是幾十年前兇殺案中兇手所遺留的毛發、皮膚或血液，只要能分離出一丁點的DNA，就能用PCR加以放大，進行比對。這也是“微量證據”的威力之所在。發明了聚合酶鏈反應，即簡易DNA擴增法，意味著PCR技術的真正誕生。到2013年，PCR已發展到第三代技術。武漢組織RT-PCR檢測技術方案

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