Real-time PCR螢光染料摻入法:在PCR反應體系中，加入過量SYBR螢光染料，SYBR螢光染料特異性地摻入DNA雙鏈后，發射螢光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發射任何螢光信號，從而保證螢光信號的增加與PCR產物的增加完全同步。此方法適用于：1、靈敏度高：使用SYBR可使螢光效果增強到1000倍以上。2、通用性好,不需要設計探針,方法簡便,省時,價格低廉。3、通用型方法，在國內外科研中普遍使用。4、高通量大規模的定量PCR檢測。5、專一性要求不高的定量PCR檢測。Real-time PCR可看作是生物體外的特殊DNA復制。上海實時Real-time PCR服務

Real-time PCR：基線（baseline)：通常是3－15個循環的熒光信號，同一次反應中針對不同的基因需單獨設置基線。閾值（threshold)：自動設置是3-15個循環的熒光信號的標準偏差的10倍。手動設置：置于指數擴增期，剛好可以清楚地看到熒光信號明顯增強。同一次反應中針對不同的基因可單獨設置閾值，但對于同一個基因擴增一定要用同一個閾值。Ct值：與起始濃度的對數成線性關系，分析定量時候一般取Ct:15-35.太大或者太小都會導致定量的不準確。相對定量：通過與內參基因Ct值之間的相差來計算基因之間的表達差異,一般是2-△△Ct。或者是考慮擴增效率的Pfaffl法。上海實時Real-time PCR服務Real-time PCR主要指在PCR反應體系中加入熒光物質。

聚合酶鏈反應同時擴增單個精子中幾個基因座的能力增強了極大地增強了通過研究減數分裂后染色體交叉來進行基因定位的傳統任務。通過分析數千個單個精子，已經直接觀察到非常緊密基因座之間罕見的交叉事件。類似地，可以分析異常的缺失、插入、易位或倒位，所有這些都無需等待(或支付)漫長而艱苦的受精、胚胎發生等過程。定點突變：聚合酶鏈反應可用于產生突變基因，突變由科學家隨意選擇。可以選擇這些突變來理解蛋白質是如何完成其功能的，并改變或改善蛋白質功能。聚合酶鏈式反應的模板的取材主要依據PCR的擴增對象，可以是病原體標本如病毒、細菌、菌類等。

聚合酶鏈式反應的試驗污染：陽性對照，在建立PCR反應實驗室及一般的檢驗單位都應設有PCR陽性對照，它是PCR反應是否成功、產物條帶位置及大小是否合乎理論要求的一個重要的參考標志。陽性對照要選擇擴增度中等、重復性好，經各種鑒定是該產物的標本，如以重組質粒為陽性對照，其含量宜低不宜高（100個拷貝以下）。但陽性對照尤其是重組質粒及高濃度陽性標本，其對檢測或擴增樣品污染的可能性很大。因而當某一PCR試劑經自己使用穩定。Real-time PCR從用途上分可以分為定性分析和定量分析。

Real-time PCR實驗常用的RNA酶抑制劑：1.焦磷酸二乙酯（DEPC）：是一種強烈但不徹底的RNA酶抑制劑。它通過和RNA酶的活性基團組氨酸的咪唑環結合使蛋白質變性，從而抑制酶的活性。2.異硫氰酸胍：目前被認為是較有效的RNA酶抑制劑，它在裂解組織的同時也使RNA酶失活。它既可破壞細胞結構使核酸從蛋白中解離出來，又對RNA酶有強烈的變性作用。3.氧釩核糖核苷復合物：由氧化釩離子和核苷形成的復合物，它和RNA酶結合形成過渡態類物質，幾乎能完全抑制RNA酶的活性。4.RNA酶的蛋白抑制劑（RNasin）：從大鼠肝或人胎盤中提取得來的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一種非競爭性抑制劑，可以和多種RNA酶結合，使其失活。5.其它：SDS、尿素、硅藻土等對RNA酶也有一定抑制作用。實時熒光定量PCR無需內標是建立在兩個基礎之上的。上海實時Real-time PCR服務

聚合酶鏈式反應又稱多聚酶鏈式反應。上海實時Real-time PCR服務

PCR的反應條件：dNTP濃度過高會加快反應速度，但同時還可以增加堿基的錯誤摻入率。引物濃度過高會引起錯配和非特異性產物擴增。TaqDNA聚合酶濃度過高會引起錯配和非特異性產物擴增，低則合成產物量減少。TaqDNA聚合酶無校正功能，摻入錯誤率達2*E-4個核苷酸，一個30個循環的擴增反應0.1%-0.25%總錯誤率。在90～95度下可使整個基因組的DNA變性為單鏈。一般94～95度30～60s。時間過長使TaqDNA聚合酶失活和dNTP破壞增多。DNA很快冷卻到40～60度使引物和模板結合。引物長度在15～25時退火溫度。熱啟動/冷完成聚合酶鏈反應是通過新的雜合聚合酶實現的，這些酶在環境溫度下不活躍。上海實時Real-time PCR服務

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