PCR的反應條件：dNTP濃度過高會加快反應速度，但同時還可以增加堿基的錯誤摻入率。引物濃度過高會引起錯配和非特異性產物擴增。TaqDNA聚合酶濃度過高會引起錯配和非特異性產物擴增，低則合成產物量減少。TaqDNA聚合酶無校正功能，摻入錯誤率達2*E-4個核苷酸，一個30個循環的擴增反應0.1%-0.25%總錯誤率。在90～95度下可使整個基因組的DNA變性為單鏈。一般94～95度30～60s。時間過長使TaqDNA聚合酶失活和dNTP破壞增多。DNA很快冷卻到40～60度使引物和模板結合。引物長度在15～25時退火溫度。熱啟動/冷完成聚合酶鏈反應是通過新的雜合聚合酶實現的，這些酶在環境溫度下不活躍。實時熒光定量PCR通過內參或者外參法對待測樣品中的特定DNA序列進行定量分析的方法。蘇州骨頭熒光定量PCR服務

Real-time PCR：實時熒光定量PCR是目前確定樣品中DNA(或cDNA)拷貝數較敏感、較準確的方法。如果用于RNA檢測，這被稱為逆轉錄實時PCR即（Real-timeRT-PCR）是實時PCR法，它是指對DNA或經過反轉入（RT-PCR）的RNA通過聚合酶鏈式反應并實時監測DNA的放大過程，在擴增的指數增長期就測量擴增產物，因為擴增指數增長期測量值與特異DNA（RNA）起始量存在相關性，從而實現定量檢測。Real-time PCR的基本目標是精確測量和鑒別非常微量的特異性核酸，從而可通過監測CT值而實現對原始目標基因的含量定量。實時熒光定量PCR法較大的優點是克服了終點PCR法進入平臺期或叫飽和期后定量的較大誤差，實現DNA/RNA的精確定量。該技術不單單實現了對DNA/RNA模板的定量，而且具有靈敏度和特異性高、能實現多重反應、自動化程度高、無污染、實時和準確等特點，該技術在醫學臨床檢驗及臨床醫學研究方面有著重要的意義。蘇州骨頭熒光定量PCR服務Real-time PCR反應的一個主要限制是，為了產生其選擇性擴增的引物，需要目標序列的先前信息。

聚合酶鏈式反應（PCR）是一種用于放大擴增特定的DN段的分子生物學技術，它可看作是生物體外的特殊DNA復制，PCR的很大特點是能將微量的DNA大幅增加。因此，無論是化石中的古生物、歷史人物的殘骸，還是幾十年前兇殺案中兇手所遺留的毛發、皮膚或血液，只要能分離出一丁點的DNA，就能用PCR加以放大，進行比對。這也是“微量證據”的威力之所在。發明了聚合酶鏈反應，即簡易DNA擴增法，意味著PCR技術的真正誕生。到2013年，PCR已發展到第三代技術。

聚合酶鏈式反應的試驗污染：PCR反應的很大特點是具有較大擴增能力與極高的靈敏性，但令人腦袋不適的問題是易污染，極其微量的污染即可造成假陽性的產生。污染原因：標本間交叉污染：標本污染主要有收集標本的容器被污染，或標本放置時，由于密封不嚴溢于容器外，或容器外粘有標本而造成相互間交叉污染；標本核酸模板在提取過程中，由于吸樣污染導致標本間污染；有些微生物標本尤其是病毒可隨氣溶膠或形成氣溶膠而擴散，導致彼此間的污染。PCR試劑的污染：主要是由于在PCR試劑配制過程中，由于加樣、容器、雙蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染。如果基因的基因組DNA序列是已知的，逆轉錄-聚合酶鏈反應可以用來繪制基因中外顯子和內含子的位置。定量聚合酶鏈反應或者實時聚合酶鏈反應不要與逆轉錄允許估計樣品中存在的給定序列的量。

Real-time PCR的染料法和探針法的選擇：進行mRNA表達量的測定，采用染料法是比較經濟實惠的；染料法可以通過比較熔解曲線的熔解峰位置得到產物特異性的情況；目的基因和內參基因分管檢測，染料法可以選用Realtime染料PCRPreMIX，探針法主要應用于病毒RNA的檢測；以及單位點突變（SNP）；多基因的合并檢測，探針法還可用于同一個反應中同時檢測目的基因和內參基因的情況；而染料法則必須分管檢測。Real-time PCR：實時熒光定量PCR技術（Real-timequantitativePolymeraseChainReaction簡稱Real-time PCR）是在定性PCR技術基礎上發展起來的核酸定量技術。實時熒光定量在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監測整個PCR進程，使每一個循環變得“可見”，之后通過Ct值和標準曲線對樣品中的DNA(orcDNA)的起始濃度進行定量的方法。Real-time PCR是在PCR擴增過程中，通過熒光信號，對PCR進程進行實時檢測。蘇州骨頭熒光定量PCR服務

實時熒光定量PCR以熒光化學物質測每次聚合酶鏈式反應（PCR）循環后產物總量的方法。蘇州骨頭熒光定量PCR服務

Real-time PCR式反應準備：10×擴增緩沖液、4種dNTP混合物（終濃度）、引物（終濃度）、模板DNA、TaqDNA聚合酶、Mg2+（終濃度）、補加雙蒸水等。其中dNTP、引物、模板DNA、TaqDNA聚合酶以及Mg2+的加量（或濃度）可根據實驗調整，以上表格只提供大致參考值。PCR反應五要素：參加PCR反應的物質主要有五種即：引物(PCR引物為DN段，細胞內DNA復制的引物為一段RNA鏈）、酶、dNTP、模板和緩沖液（其中需要Mg2+）。引物有多種設計方法，由PCR在實驗中的目的決定，但基本原則相同。蘇州骨頭熒光定量PCR服務

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