Real-time PCR鏈式反應的特點：靈敏度高：PCR產(chǎn)物的生成量是以指數(shù)方式增加的，能將皮克(pg=10-12）量級的起始待測模板擴增到微克（μg=-6）水平。能從100萬個細胞中檢出一個靶細胞；在病毒的檢測中，PCR的靈敏度可達3個RFU(空斑形成單位）；在細菌學中很小檢出率為3個細菌。簡便、快速：PCR反應用耐高溫的TaqDNA聚合酶，一次性地將反應液加好后，即在DNA擴增液和水浴鍋上進行變性-退火-延伸反應，一般在2～4小時完成擴增反應。擴增產(chǎn)物一般用電泳分析，不一定要用同位素，無放射性污染、易推廣。純度要求低：不需要分離病毒或細菌及培養(yǎng)細胞，DNA粗制品及RNA均可作為擴增模板。可直接用臨床標本如血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細胞、活組織等DNA擴增檢測。武漢微量Real-time PCR供應商聚合酶鏈反應的試劑應分配到一次性的等分試樣中。聚合酶鏈反應的這種能力增強了許多方法，例如生成雜交探針用于雜交。無錫分子生物學RT-PCR檢測技術設計公司

Real-time PCR：對擴增技術的修飾可以從完全未知的基因組中提取片段，或者可以產(chǎn)生感興趣區(qū)域的單鏈。聚合酶鏈反應有許多應用于傳統(tǒng)的DNA克隆。它可以從更大的基因組中提取片段以插入載體，這可能只有少量可用。使用一組“載體引物”，它還可以分析或提取已經(jīng)插入載體的片段。聚合酶鏈反應方案的一些改變可以產(chǎn)生突變(通用的或定點的)插入片段。聚合酶鏈反應可以選擇這些突變來理解蛋白質(zhì)是如何完成其功能的，并改變或改善蛋白質(zhì)功能。無錫分子生物學RT-PCR檢測技術設計公司Real-time PCR探針法普遍用于人類傳染病的診斷和病原定量。

引物的設計注意事項：1，引物設計要跨內(nèi)含子，不能在一個外顯子上（我們的實驗是以cDNA為模板來擴增的，如果有DNA污染的話，因為DNA上含有分子量很大的內(nèi)含子，不可能完成擴增。這對我們消除整個實驗的誤差起很大的作用）。2，引物設計的時候要盡可能設計在同一退火溫度，方便于以后同時擴增很多不同的基因片段。但是如果相差比較大，就得分開做，浪費模板，浪費管家基因，所以每個實驗室設計引物的時候要盡可能一致，這樣就不用每次查退火溫度，且對整個實驗有利。

Real-time PCR與普通PCR的實驗目的不同，所以對引物的設計要求也不同。普通PCR的實驗目的只是為了獲得目的基因產(chǎn)物，允許有非特異擴增，只要目標條帶清晰明亮，就可以通過切膠回收的方法回收目標條帶，之后進行后續(xù)的克隆、測序。但Real-time PCR的目的是為了讓目的基因按照理論值或是按照接近理論值進行擴增，只有這樣的擴增后續(xù)由Ct值推算出的起始量模板量才準確，基于此，Real-time PCR對非特異性擴增和引物二聚體的存在有較嚴格的要求。Real-time PCR探針法適用于擴增序列專一的體系的檢測。

Real-time PCR：所謂Real-time PCR技術，是指在PCR反應體系中加入螢光基團，利用螢光信號累積實時監(jiān)測整個PCR進程，之后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。利用螢光信號的變化實時檢測PCR擴增反應中每一個循環(huán)擴增產(chǎn)物量的變化，通過Ct值和標準曲線的分析對起始模板進行定量分析。Real-time PCR技術即實時螢光定量PCR避免了傳統(tǒng)PCR以終產(chǎn)物監(jiān)測定量產(chǎn)生的偏差，提高實驗的重複性。該技術已經(jīng)被普遍用于監(jiān)測細胞mRNA表達量的變化；比較不同組織的mRNA表達差異；驗證基因晶片，siRNA干擾的實驗結果。實時熒光定量PCR是一種采用外標準曲線定量的方法。無錫分子生物學RT-PCR檢測技術設計公司

PCR由一系列20-40次重復的溫度變化組成，稱為熱循環(huán)。無錫分子生物學RT-PCR檢測技術設計公司

引物的設計對于這個實驗至關重要，因為Real-time PCR的檢測靈敏度比較高，所以相應的對引物設計的要求就很高。普通的要求規(guī)則大家都知道，還有幾點必須注意：1，引物的錯配率（引物錯配形成引物二聚體，但是SYBR照樣能嵌入進去，結果導致實驗結果的誤差很大，重復性也不好）。2，引物的特異性一定要高（不像常規(guī)PCR，引物同源性不高，只要兩條產(chǎn)物的片段長度相差足夠大，在電泳的時候能夠區(qū)分開就可以。Real-time PCR只有在熔解曲線的時候能分開，所以這就造成整個實驗結果誤差很大，不可信）。無錫分子生物學RT-PCR檢測技術設計公司

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