所謂real-timeQ-PCR技術(shù),是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基因,利用熒光信號(hào)累積實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程,之后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。在real-time技術(shù)的發(fā)展過(guò)程中,兩個(gè)重要的發(fā)現(xiàn)起著關(guān)鍵的作用:(1)TaqDNA多聚酶的5′核酸外切酶活性的發(fā)現(xiàn),它能降解特異性熒光記探針,因此使得間接的檢測(cè)PCR產(chǎn)物成為可能。(2)此后熒光雙標(biāo)記探針的運(yùn)用使在一密閉的反應(yīng)管中能實(shí)時(shí)地監(jiān)測(cè)反應(yīng)全過(guò)程。這兩個(gè)發(fā)現(xiàn)的結(jié)合以及相應(yīng)的儀器和試劑的商品化發(fā)展導(dǎo)致real-timeQ-PCR方法在研究工作中的運(yùn)用。Real-time PCR的基本目標(biāo)是精確測(cè)量和鑒別非常微量的特異性核酸。溫州組織數(shù)字PCR研究方案
Real-time PCR-傳統(tǒng)定量PCR:擴(kuò)增后用內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物,競(jìng)爭(zhēng)性模板的產(chǎn)物被酶解為兩個(gè)片段,而待測(cè)模板不被酶切,可通過(guò)電泳或高效液相將兩種產(chǎn)物分開(kāi),分別測(cè)定熒光強(qiáng)度,根據(jù)已知模板推測(cè)未知模板的起始拷貝數(shù)。PCR-ELISA法:利用地高辛或生物素等標(biāo)記引物,擴(kuò)增產(chǎn)物被固相板上特異的探針?biāo)Y(jié)合,再加入抗地高辛或生物素酶標(biāo)抗體-辣根過(guò)氧化物酶結(jié)合物,之后酶使底物顯色。常規(guī)的PCR-ELISA法只是定性實(shí)驗(yàn),若加入內(nèi)標(biāo),作出標(biāo)準(zhǔn)曲線,也可實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)目的。溫州組織數(shù)字PCR研究方案聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)又稱多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。
Real-time PCR與普通PCR的實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟煌詫?duì)引物的設(shè)計(jì)要求也不同。普通PCR的實(shí)驗(yàn)?zāi)康闹皇菫榱双@得目的基因產(chǎn)物,允許有非特異擴(kuò)增,只要目標(biāo)條帶清晰明亮,就可以通過(guò)切膠回收的方法回收目標(biāo)條帶,之后進(jìn)行后續(xù)的克隆、測(cè)序。但Real-time PCR的目的是為了讓目的基因按照理論值或是按照接近理論值進(jìn)行擴(kuò)增,只有這樣的擴(kuò)增后續(xù)由Ct值推算出的起始量模板量才準(zhǔn)確,基于此,Real-time PCR對(duì)非特異性擴(kuò)增和引物二聚體的存在有較嚴(yán)格的要求。
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的試驗(yàn)污染:PCR反應(yīng)的很大特點(diǎn)是具有較大擴(kuò)增能力與極高的靈敏性,但令人腦袋不適的問(wèn)題是易污染,極其微量的污染即可造成假陽(yáng)性的產(chǎn)生。污染原因:標(biāo)本間交叉污染:標(biāo)本污染主要有收集標(biāo)本的容器被污染,或標(biāo)本放置時(shí),由于密封不嚴(yán)溢于容器外,或容器外粘有標(biāo)本而造成相互間交叉污染;標(biāo)本核酸模板在提取過(guò)程中,由于吸樣污染導(dǎo)致標(biāo)本間污染;有些微生物標(biāo)本尤其是病毒可隨氣溶膠或形成氣溶膠而擴(kuò)散,導(dǎo)致彼此間的污染。PCR試劑的污染:主要是由于在PCR試劑配制過(guò)程中,由于加樣、容器、雙蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染。如果基因的基因組DNA序列是已知的,逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)可以用來(lái)繪制基因中外顯子和內(nèi)含子的位置。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的模板的取材主要依據(jù)PCR的擴(kuò)增對(duì)象。
Real-time PCR鏈反應(yīng):嵌套聚合酶鏈反應(yīng):通過(guò)減少DNA非特異性擴(kuò)增的背景,提高DNA擴(kuò)增的特異性。兩組引物用于兩個(gè)連續(xù)的PCR。在個(gè)反應(yīng)中,一對(duì)引物用于產(chǎn)生DNA產(chǎn)物,除了預(yù)期的靶之外,該產(chǎn)物可能仍然由非特異性擴(kuò)增的DN段組成。然后用一組引物將產(chǎn)物用于第二次聚合酶鏈反應(yīng),所述引物的結(jié)合位點(diǎn)完全或部分不同于次反應(yīng)中使用的每個(gè)引物,并且位于其中的3’。嵌套式PCR在特異性擴(kuò)增長(zhǎng)DN段方面通常比傳統(tǒng)PCR更成功,但它需要更詳細(xì)的目標(biāo)序列知識(shí)。重疊延伸聚合酶鏈反應(yīng)或者通過(guò)重疊延伸拼接(SOEing):一種用于將兩個(gè)或多個(gè)含有互補(bǔ)序列的DN段拼接在一起的基因工程技術(shù)。它用于連接含有基因、調(diào)節(jié)序列或突變的DN段;這項(xiàng)技術(shù)可以創(chuàng)造特定的長(zhǎng)DNA構(gòu)建體。它還可以將缺失、插入或點(diǎn)突變引入DNA序列。實(shí)時(shí)設(shè)備的軟件能使收集到的數(shù)據(jù)進(jìn)行正常化處理來(lái)彌補(bǔ)背景熒光的差異。溫州組織數(shù)字PCR研究方案
Real-time PCR探針?lè)ň哂懈哌m應(yīng)性和可靠性。溫州組織數(shù)字PCR研究方案
Real-time PCR螢光染料摻入法:在PCR反應(yīng)體系中,加入過(guò)量SYBR螢光染料,SYBR螢光染料特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后,發(fā)射螢光信號(hào),而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會(huì)發(fā)射任何螢光信號(hào),從而保證螢光信號(hào)的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。此方法適用于:1、靈敏度高:使用SYBR可使螢光效果增強(qiáng)到1000倍以上。2、通用性好,不需要設(shè)計(jì)探針,方法簡(jiǎn)便,省時(shí),價(jià)格低廉。3、通用型方法,在國(guó)內(nèi)外科研中普遍使用。4、高通量大規(guī)模的定量PCR檢測(cè)。5、專一性要求不高的定量PCR檢測(cè)。溫州組織數(shù)字PCR研究方案
上海司鼎生物科技有限公司是一家集研發(fā)、制造、銷售為一體的****,公司位于放鶴路1088號(hào),成立于2016-06-07。公司秉承著技術(shù)研發(fā)、客戶優(yōu)先的原則,為國(guó)內(nèi)免疫印跡(WB)技術(shù)服務(wù),熒光定量PCR技術(shù)服務(wù),膜片鉗電生理技術(shù)服務(wù),在體光纖成像記錄技術(shù)服務(wù)的產(chǎn)品發(fā)展添磚加瓦。公司主要經(jīng)營(yíng)免疫印跡(WB)技術(shù)服務(wù),熒光定量PCR技術(shù)服務(wù),膜片鉗電生理技術(shù)服務(wù),在體光纖成像記錄技術(shù)服務(wù)等產(chǎn)品,產(chǎn)品質(zhì)量可靠,均通過(guò)醫(yī)藥健康行業(yè)檢測(cè),嚴(yán)格按照行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行。目前產(chǎn)品已經(jīng)應(yīng)用與全國(guó)30多個(gè)省、市、自治區(qū)。司鼎;OriCell為用戶提供真誠(chéng)、貼心的售前、售后服務(wù),產(chǎn)品價(jià)格實(shí)惠。公司秉承為社會(huì)做貢獻(xiàn)、為用戶做服務(wù)的經(jīng)營(yíng)理念,致力向社會(huì)和用戶提供滿意的產(chǎn)品和服務(wù)。上海司鼎生物科技有限公司注重以人為本、團(tuán)隊(duì)合作的企業(yè)文化,通過(guò)保證免疫印跡(WB)技術(shù)服務(wù),熒光定量PCR技術(shù)服務(wù),膜片鉗電生理技術(shù)服務(wù),在體光纖成像記錄技術(shù)服務(wù)產(chǎn)品質(zhì)量合格,以誠(chéng)信經(jīng)營(yíng)、用戶至上、價(jià)格合理來(lái)服務(wù)客戶。建立一切以客戶需求為前提的工作目標(biāo),真誠(chéng)歡迎新老客戶前來(lái)洽談業(yè)務(wù)。