聚合酶鏈式反應(PCR)是一種用于放大擴增特定的DN段的分子生物學技術,它可看作是生物體外的特殊DNA復制,PCR的很大特點是能將微量的DNA大幅增加。因此,無論是化石中的古生物、歷史人物的殘骸,還是幾十年前兇殺案中兇手所遺留的毛發、皮膚或血液,只要能分離出一丁點的DNA,就能用PCR加以放大,進行比對。這也是“微量證據”的威力之所在。發明了聚合酶鏈反應,即簡易DNA擴增法,意味著PCR技術的真正誕生。到2013年,PCR已發展到第三代技術。像所有酶一樣,DNA聚合酶也容易出錯,這反過來會導致產生的PCR片段發生突變。寧波細胞熒光PCR服務
Real-time PCR:實時熒光定量PCR是目前確定樣品中DNA(或cDNA)拷貝數較敏感、較準確的方法。如果用于RNA檢測,這被稱為逆轉錄實時PCR即(Real-timeRT-PCR)是實時PCR法,它是指對DNA或經過反轉入(RT-PCR)的RNA通過聚合酶鏈式反應并實時監測DNA的放大過程,在擴增的指數增長期就測量擴增產物,因為擴增指數增長期測量值與特異DNA(RNA)起始量存在相關性,從而實現定量檢測。Real-time PCR的基本目標是精確測量和鑒別非常微量的特異性核酸,從而可通過監測CT值而實現對原始目標基因的含量定量。實時熒光定量PCR法較大的優點是克服了終點PCR法進入平臺期或叫飽和期后定量的較大誤差,實現DNA/RNA的精確定量。該技術不單單實現了對DNA/RNA模板的定量,而且具有靈敏度和特異性高、能實現多重反應、自動化程度高、無污染、實時和準確等特點,該技術在醫學臨床檢驗及臨床醫學研究方面有著重要的意義。寧波細胞熒光PCR服務實時熒光定量PCR法較大的優點是克服了終點PCR法進入平臺期或叫飽和期后定量的較大誤差。
Real-time PCR探針法適用于:1、具有高適應性和可靠性,實驗結果穩定重複性好,特異性更高。2、適用于擴增序列專一的體系的檢測。3、樣品中靶基因含量過低的定量PCR檢測。4、靶基因的特異序列較短,無論怎樣較佳化引物設計條件都不能解決。5、存在與靶基因同源的序列,在PCR中容易出現非特異性擴增,對特異性要求較高的定量。6、普遍用于人類傳染病的診斷和病原定量,在動物病原體基因的檢測,畜禽產品的檢驗檢疫,生物製品的鑒定。Real-time PCR探針法:PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的螢光探針,該探針為一寡核苷酸,兩端分別標記一個報告螢光基團和一個淬滅螢光基團。探針完整時,報告基團發射的螢光信號被淬滅基團吸收;PCR擴增時,Taq酶的5’-3’外切酶活性將探針酶切降解,使報告螢光基團和淬滅螢光基團分離,從而螢光監測系統可接收到螢光信號,即每擴增一條DNA鏈,就有一個螢光分子形成,實現了螢光信號的累積與PCR產物形成完全同步。
實時熒光定量PCR:實時熒光定量PCR技術有效地解決了傳統定量只能終點檢測的局限,實現了每一輪循環均檢測一次熒光信號的強度,并記錄在電腦軟件之中,通過對每個樣品Ct值的計算,根據標準曲線獲得定量結果。因此,實時熒光定量PCR無需內標是建立在兩個基礎之上的:Ct值的重現性PCR循環在到達Ct值所在的循環數時,剛剛進入真正的指數擴增期(對數期),此時微小誤差尚未放大,因此Ct值的重現性極好,即同一模板不同時間擴增或同一時間不同管內擴增,得到的Ct值是恒定的。重疊延伸聚合酶鏈反應用于連接含有基因、調節序列或突變的DN段。
所謂real-timeQ-PCR技術,是指在PCR反應體系中加入熒光基因,利用熒光信號累積實時監測整個PCR進程,之后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。在real-time技術的發展過程中,兩個重要的發現起著關鍵的作用:(1)TaqDNA多聚酶的5′核酸外切酶活性的發現,它能降解特異性熒光記探針,因此使得間接的檢測PCR產物成為可能。(2)此后熒光雙標記探針的運用使在一密閉的反應管中能實時地監測反應全過程。這兩個發現的結合以及相應的儀器和試劑的商品化發展導致real-timeQ-PCR方法在研究工作中的運用。流聚合酶鏈反應:一種偽等溫PCR方法。寧波細胞熒光PCR服務
聚合酶鏈反應是是一種簡單,廉價和可靠的方法復制DN段。寧波細胞熒光PCR服務
Real-time PCR從用途上分可以分為定性分析和定量分析:定性分析指的是用于分析待檢測的樣本中是否存在我們想要檢測的成分,即待檢測成分有無的分析。通常,定性分析可以應用于病毒以及病原菌的檢測,物種鑒定以及基因分型等。病毒及病原菌檢測,如SARS、H1N1病毒,都可以通過Real-time PCR的方法進行高靈敏度的檢測,定性分析樣本是否已被病毒傳播。物種鑒定如我們國家的一些檢驗檢疫機構,想要檢測進口的牛肉制品中是否含有雞源、豬源或鴨源等成分,或者用于檢測羊奶中是否會摻有牛奶等等,可以通過Real-time PCR的方法進行檢測。基因分型,如啤酒型,肥胖型基因的檢測,就是Real-time PCR在基因分型方面的應用。寧波細胞熒光PCR服務
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