聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)：Taq(水生棲熱菌)聚合酶耐熱DNA聚合酶的很好活性溫度約為75-80°C(167-176°F),盡管該酶通常使用72°C(162°F)的溫度。在該步驟中，DNA聚合酶通過(guò)從反應(yīng)混合物中添加在5’-至-3’方向上與模板互補(bǔ)的游離DNA鏈來(lái)合成與DNA模板鏈互補(bǔ)的新DNA鏈，在新生(伸長(zhǎng))DNA鏈的末端，將dNTPs的5'-磷酸基與3'-羥基縮合。延伸所需的精確時(shí)間取決于所使用的DNA聚合酶和要擴(kuò)增的DNA目標(biāo)區(qū)域的長(zhǎng)度。根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，在很好溫度下，大多數(shù)DNA聚合酶每分鐘聚合一千個(gè)堿基。在很好條件下(即，如果沒(méi)有限制底物或試劑的限制)，在每個(gè)延伸/延伸步驟中，DNA靶序列的數(shù)量加倍。隨著每一個(gè)連續(xù)的循環(huán)，原始模板鏈加上所有新產(chǎn)生的鏈成為下一輪延伸的模板鏈，導(dǎo)致特定DNA目標(biāo)區(qū)域的指數(shù)(幾何)擴(kuò)增。為了很大限度地減少污染的可能性，調(diào)查人員應(yīng)該為試劑制備、聚合酶鏈反應(yīng)和產(chǎn)品分析預(yù)留單獨(dú)的房間。徐州細(xì)胞定量PCR原理及步驟

聚合酶鏈反應(yīng)允許快速生產(chǎn)短DN段，即使已知的引物序列不超過(guò)兩個(gè)。聚合酶鏈反應(yīng)的這種能力增強(qiáng)了許多方法，例如生成雜交 探針用于 Southern 或northern blot 雜交。聚合酶鏈反應(yīng)為這些技術(shù)提供了大量的純DNA，有時(shí)是單鏈的，甚至可以從非常少量的起始材料中進(jìn)行分析。脫氧核糖核酸測(cè)序的任務(wù)也可以通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)來(lái)輔助完成。已知的DN段可以很容易地從患有遺傳疾病突變的患者體內(nèi)產(chǎn)生。對(duì)擴(kuò)增技術(shù)的修飾可以從完全未知的基因組中提取片段，或者可以產(chǎn)生感興趣區(qū)域的單鏈。聚合酶鏈反應(yīng)有許多應(yīng)用于傳統(tǒng)的 DNA克隆。它可以從更大的基因組中提取片段以插入載體，這可能只有少量可用。使用一組“載體引物”，它還可以分析或提取已經(jīng)插入載體的片段。聚合酶鏈反應(yīng)方案的一些改變可以產(chǎn)生突變(通用的或定點(diǎn)的)插入片段。徐州細(xì)胞定量PCR原理及步驟聚合酶鏈反應(yīng)應(yīng)經(jīng)常使用帶有一次性柱塞和超長(zhǎng)移液器吸頭的移液器。

聚合酶鏈反應(yīng)的常見(jiàn)問(wèn)題分析與解決方法：擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)多條帶(雜帶)：引物用量偏大，引物的特異性不高。應(yīng)調(diào)換引物或降低引物的使用量。循環(huán)的次數(shù)過(guò)多。適當(dāng)增加模板的量，減少循環(huán)次數(shù)。酶的用量偏高或酶的質(zhì)量不好，應(yīng)降低酶量或調(diào)換另一來(lái)源的酶。退火溫度偏低，退火及延伸時(shí)間偏長(zhǎng)。應(yīng)提高退火溫度，減少變性與延伸時(shí)間，也可采用二種溫度的PCR擴(kuò)增。以2度為梯度設(shè)計(jì)梯度PCR反應(yīng)優(yōu)化退火溫度。 樣品處理不當(dāng)。Mg2+濃度偏高，因適當(dāng)調(diào)整Mg2+使用濃度。若為PCR試劑盒，也可能時(shí)試劑盒本身質(zhì)量有問(wèn)題。復(fù)制提前終止。使用非熱啟動(dòng)的聚合酶時(shí)常有發(fā)生。冰上準(zhǔn)備反應(yīng)體系或采用熱啟動(dòng)聚合酶。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)：模板的制備，PCR的模板可以是DNA，也可以是RNA。模板的取材主要依據(jù)PCR的擴(kuò)增對(duì)象，可以是病原體標(biāo)本如病毒、細(xì)菌、菌類等。也可以是病理生理標(biāo)本如細(xì)胞、血液、羊水細(xì)胞等。法醫(yī)學(xué)標(biāo)本有血斑、精斑、毛發(fā)等。標(biāo)本處理的基本要求是除去雜質(zhì)，并部分純化標(biāo)本中的核酸。多數(shù)樣品需要經(jīng)過(guò)SDS和蛋白酶K處理。難以破碎的細(xì)菌，可用溶菌酶加EDTA處理。所得到的粗制DNA，經(jīng)酚、氯仿抽提純化，再用乙醇沉淀后用作PCR反應(yīng)模板。電子PCR被提出作為分子生物學(xué)的教育工具。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的常見(jiàn)問(wèn)題：陰性：需注意的是有時(shí)忘加Taq酶或溴乙錠。引物：引物質(zhì)量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對(duì)稱，是PCR失敗或擴(kuò)增條帶不理想、容易彌散的常見(jiàn)原因。有些批號(hào)的引物合成質(zhì)量有問(wèn)題，兩條引物一條濃度高，一條濃度低，造成低效率的不對(duì)稱擴(kuò)增，對(duì)策為：選定一個(gè)好的引物合成單位。引物的濃度不但要看OD值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現(xiàn)，而且兩引物帶的亮度應(yīng)大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無(wú)條帶，此時(shí)做PCR有可能失敗，應(yīng)和引物合成單位協(xié)商解決。如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時(shí)要平衡其濃度。引物應(yīng)高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長(zhǎng)期放冰箱冷藏部分，導(dǎo)致引物變質(zhì)降解失效。引物設(shè)計(jì)不合理，如引物長(zhǎng)度不夠，引物之間形成二聚體等。PCR產(chǎn)物的生成量是以指數(shù)方式增加的，能將皮克量級(jí)的起始待測(cè)模板擴(kuò)增到微克水平。徐州細(xì)胞定量PCR原理及步驟

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)：DNA的半保留復(fù)制是生物進(jìn)化和傳代的重要途徑。徐州細(xì)胞定量PCR原理及步驟

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的常見(jiàn)問(wèn)題：Mg2+濃度：Mg2+離子濃度對(duì)PCR擴(kuò)增效率影響很大，濃度過(guò)高可降低PCR擴(kuò)增的特 異性，濃度過(guò)低則影響PCR擴(kuò)增產(chǎn)量甚至使PCR擴(kuò)增失敗而不出擴(kuò)增條帶。反應(yīng)體積的改變：通常進(jìn)行PCR擴(kuò)增采用的體積為20ul、30ul、50ul。或100ul，應(yīng)用多 大體積進(jìn)行PCR擴(kuò)增，是根據(jù)科研和臨床檢測(cè)不同目的而設(shè)定，在做小體積如20ul 后，再做大體積時(shí)，一定要模索條件，否則容易失敗。物理原因：變性對(duì)PCR擴(kuò)增來(lái)說(shuō)相當(dāng)重要，如變性溫度低，變性時(shí)間短，極有可能出現(xiàn)假陰性；退火溫度過(guò)低，可致非特異性擴(kuò)增而降低特異性擴(kuò)增效率退火溫度過(guò)高影響引物與模板的結(jié)合而降低PCR擴(kuò)增效率。有時(shí)還有必要用標(biāo)準(zhǔn)的溫度計(jì)，檢測(cè)一下擴(kuò)增儀或水溶鍋內(nèi)的變性、退火和延伸溫度，這也是PCR失敗的原因之一。徐州細(xì)胞定量PCR原理及步驟

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