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來源: 發(fā)布時間:2022年08月15日

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是一種在體外快速擴增特定基因或DNA序列的方法,故又稱為基因的體外擴增法。PCR技術(shù)類似于DNA的天然復(fù)制過程,其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR能快速特異擴增任何已知目的基因或DN段,并能輕易在皮克(pg)水平起始DNA混合物中的目的基因擴增達到納克、微克、毫克級的特異性DN段。因此,PCR技術(shù)一經(jīng)問世就被迅速而較廣地用于分子生物學(xué)的各個領(lǐng)域。 異常結(jié)果: 各種疾病所致的異常,例如梅毒。一期梅毒。即硬下疳 ,潛伏期2-4周,外生殖器部位發(fā)生暗紅色硬腫塊 、淺潰瘍 ,有軟骨樣硬度,周圍淋巴結(jié)腫大。二期梅毒。在一期梅毒 1-2 個月之后,全身皮膚、粘膜發(fā)生對稱泛發(fā)皮疹、斑疹、、疹等。粘膜可發(fā)生粘膜斑、扁平濕疣,傳染性強。三期梅毒。發(fā)生在染上后2-3年乃至10年,皮膚為樹膠樣腫,還可涉及骨、關(guān)節(jié)、心、血管,表現(xiàn)為主動脈炎、主動脈瓣閉鎖不全和主動脈瘤等,侵及神經(jīng)為脊髓癆 ,全身麻痹 ( 麻痹性癡呆 )等等。 需要檢查的人群:疑似某種特定的疾病病人,進行分子特異性檢查。像所有酶一樣,DNA聚合酶也容易出錯,這反過來會導(dǎo)致產(chǎn)生的PCR片段發(fā)生突變。徐州實時數(shù)字PCR設(shè)計公司

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聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)又稱多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng),是一項利用DNA雙鏈復(fù)制的原理,在生物體外復(fù)制特定DN段的核酸合成技術(shù)。透過這項技術(shù),可在短時間內(nèi)大量擴增目的基因,而不必依賴大腸桿菌或酵母菌等生物體。聚合酶鏈反應(yīng)是是一種簡單,廉價和可靠的方法復(fù)制DN段,這個概念適用于現(xiàn)物學(xué)和相關(guān)科學(xué)的許多領(lǐng)域。 PCR可能是分子生物學(xué)中使用很較廣的技術(shù)。這種技術(shù)被用于生物醫(yī)學(xué)研究,犯罪取證和分子考古學(xué)。通常,PCR由一系列20-40次重復(fù)的溫度變化組成,稱為熱循環(huán),每個循環(huán)通常由兩個或三個離散的溫度步驟組成。徐州實時數(shù)字PCR設(shè)計公司流聚合酶鏈反應(yīng):一種偽等溫PCR方法。

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聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng):Taq(水生棲熱菌)聚合酶耐熱DNA聚合酶的很好活性溫度約為75-80°C(167-176°F),盡管該酶通常使用72°C(162°F)的溫度。在該步驟中,DNA聚合酶通過從反應(yīng)混合物中添加在5’-至-3’方向上與模板互補的游離DNA鏈來合成與DNA模板鏈互補的新DNA鏈,在新生(伸長)DNA鏈的末端,將dNTPs的5'-磷酸基與3'-羥基縮合。延伸所需的精確時間取決于所使用的DNA聚合酶和要擴增的DNA目標(biāo)區(qū)域的長度。根據(jù)經(jīng)驗,在很好溫度下,大多數(shù)DNA聚合酶每分鐘聚合一千個堿基。在很好條件下(即,如果沒有限制底物或試劑的限制),在每個延伸/延伸步驟中,DNA靶序列的數(shù)量加倍。隨著每一個連續(xù)的循環(huán),原始模板鏈加上所有新產(chǎn)生的鏈成為下一輪延伸的模板鏈,導(dǎo)致特定DNA目標(biāo)區(qū)域的指數(shù)(幾何)擴增。

基于聚合酶鏈反應(yīng)的遺傳(或脫氧核糖核酸)指紋圖譜協(xié)議的發(fā)展已在法醫(yī)學(xué)中得到較廣應(yīng)用:遺傳指紋以其辨別力的形式,可以從世界上所有人群中獨特地區(qū)分任何一個人。微小的DNA樣本可以從犯罪現(xiàn)場,和比較的從嫌疑人那里,或者從DNA資料庫早期的證據(jù)或罪犯。這些測試的簡單版本通常用于在刑事調(diào)查中快速排除嫌疑人。幾十年前的犯罪證據(jù)可以被檢驗,確認或免責(zé)很初被定罪的人。脫氧核糖核酸指紋中較小的區(qū)別有助于親子鑒定,在親子鑒定中,一個人和他的近親相匹配。可以測試未知人類遺骸的DNA,并與可能的父母、兄弟姐妹或兒童進行比較。類似的測試可以用來確認被收養(yǎng)(或)孩子的親生父母。新生兒的實際生父也可以被確認(或排除)。重疊延伸聚合酶鏈反應(yīng)可以創(chuàng)造特定的長DNA構(gòu)建體。

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聚合酶鏈反應(yīng)的常見問題分析與解決方法:反應(yīng)緩沖液未完全融化或未充分混勻。確保反應(yīng)緩沖液融化完全并徹底混勻。引物特異性差。利用BLAST檢查引物特異性或重新設(shè)計引物。引物量過多。減少反應(yīng)體系中引物的用量。模板量過多。質(zhì)粒DNA的用量應(yīng)<50ng,而基因組DNA則應(yīng)<200ng。外源DNA污染。確保操作的潔凈。陰性對照出現(xiàn)條帶:試劑,頭,工作臺污染。使用全新的試劑和頭,對工作臺進行清潔。條帶大小與理論不符:污染。使用全新的試劑和頭,對工作臺進行清潔。模板或引物使用錯誤。更換引物和模板。基因亞型。對研究的基因進行序列分析和BLAST研究。PCR產(chǎn)物的生成量是以指數(shù)方式增加的,能將皮克量級的起始待測模板擴增到微克水平。徐州實時數(shù)字PCR設(shè)計公司

熱啟動/冷完成聚合酶鏈反應(yīng)是通過新的雜合聚合酶實現(xiàn)的,這些酶在環(huán)境溫度下不活躍。徐州實時數(shù)字PCR設(shè)計公司

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)準(zhǔn)備:PCR所用的酶主要有兩種來源:Taq和Pfu,分別來自兩種不同的噬熱菌。其中Taq擴增效率高但易發(fā)生錯配。Pfu擴增效率弱但有糾錯功能。所以實際使用時根據(jù)需要必須做不同的選擇。模板即擴增用的DNA,可以是任何來源,但有兩個原則,純度必須較高,第二濃度不能太高以免抑制。緩沖液的成分很為復(fù)雜,除水外一般包括四個有效成分:緩沖體系,一般使用HEPES或MOPS緩沖體系;一價陽離子,一般采用鉀離子,但在特殊情況下也可使用銨根離子;二價陽離子,即鎂離子,根據(jù)反應(yīng)體系確定,除特殊情況外不需調(diào)整;輔助成分,常見的有DMSO、甘油等,主要用來保持酶的活性和幫助DNA解除纏繞結(jié)構(gòu)。徐州實時數(shù)字PCR設(shè)計公司

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