聚合酶鏈式反應的常見問題：靶序列變異：如靶序列發生突變或缺失，影響引物與模板特異性結合，或因靶序列某 段缺失使引物與模板失去互補序列，其PCR擴增是不會成功的。假陽性：出現的PCR擴增條帶與目的靶序列條帶一致，有時其條帶更整齊，亮度更高。引物設計不合適：選擇的擴增序列與非目的擴增序列有同源性，因而在進行PCR擴增時，擴增出的PCR產物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現假陽性。需重新設計引物。出現片狀拖帶或涂抹帶：PCR擴增有時出現涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過多或酶的質量差，dNTP濃度過高，Mg2+濃度過高，退火溫度過低，循環次數過多引起。其對策有：減少酶量，或調換另一來源的酶。②減少dNTP的濃度。適當降低Mg2+濃 度。增加模板量，減少循環次數。聚合酶鏈式反應中的DMSO、甘油等，主要用來保持酶的活性和幫助DNA解除纏繞結構。武漢實時RT-PCR檢測技術研究方案

聚合酶鏈式反應的特點：靈敏度高：PCR產物的生成量是以指數方式增加的，能將皮克(pg=10-12）量級的起始待測模板擴增到微克（μg=-6）水平。能從100萬個細胞中檢出一個靶細胞；在病毒的檢測中，PCR的靈敏度可達3個RFU(空斑形成單位）；在細菌學中很小檢出率為3個細菌。簡便、快速：PCR反應用耐高溫的Taq DNA聚合酶，一次性地將反應液加好后，即在DNA擴增液和水浴鍋上進行變性-退火-延伸反應，一般在2～4 小時完成擴增反應。擴增產物一般用電泳分析，不一定要用同位素，無放射性污染、易推廣。純度要求低：不需要分離病毒或細菌及培養細胞，DNA 粗制品及RNA均可作為擴增模板。可直接用臨床標本如血液、體腔液、洗嗽液、毛發、細胞、活組織等DNA擴增檢測。武漢實時RT-PCR檢測技術研究方案PCR由變性-退火-延伸三個基本反應步驟構成。

逆轉錄-聚合酶鏈反應的原理是：提取組織或細胞中的總RNA，以其中的mRNA作為模板，采用Oligo（dT）或隨機引物利用逆轉錄酶反轉錄成cDNA。再以cDNA為模板進行PCR擴增，而獲得目的基因或檢測基因表達。完整RNA 的提取和純化，是進行RNA 方面的研究工作，如Nothern雜交、mRNA 分離、RT-PCR、定量PCR、cDNA合成及體外翻譯等的前提。所有ＲＮＡ的提取過程中都有五個關鍵點，即樣品細胞或組織的有效破碎；有效地使白復合體變性；對內源ＲＮＡ酶的有效抑制；有效地將ＲＮＡ從ＤＮＡ和蛋白混合物中分離；對于多糖含量高的樣品還牽涉到多糖雜質的有效除去。但其中很關鍵的是抑制RNA酶活性。RNA 的提取目前階段主要可采用兩種途徑，提取總核酸，再用氯化鋰將RNA 沉淀出來；直接在酸性條件下抽提，酸性下DNA與蛋白質進入有機相而RNA 留在水相。種提取方法將導致小分子量RNA 的丟失，目前該方法的使用頻率已很低。

聚合酶鏈式反應（PCR）是一種用于放大擴增特定的DN段的分子生物學技術，它可看作是生物體外的特殊DNA復制，PCR的很大特點是能將微量的DNA大幅增加。因此，無論是化石中的古生物、歷史人物的殘骸，還是幾十年前兇殺案中兇手所遺留的毛發、皮膚或血液，只要能分離出一丁點的DNA，就能用PCR加以放大，進行比對。這也是“微量證據”的威力之所在。由1983年美國首先提出設想，1985年由其發明了聚合酶鏈反應，即簡易DNA擴增法，意味著PCR技術的真正誕生。到2013年，PCR已發展到第三代技術。PCR產物的電泳檢測時間一般為48h以內，有些很好于當日電泳檢測，大于48h后帶型不規則甚至消失。

聚合酶鏈反應的常見問題分析與解決方法：無擴增條帶：酶失活或在反應體系中未加入酶。Taq DNA聚合酶因保存或運輸不當而失活，往往通過更換新酶或用另一來源的酶以獲得滿意的結果。模板含有雜質。特別是對甲醛固定及石蠟包埋的組織常含甲酸，造成DNA脫嘌呤而影響PCR的結果。變性溫度是否準確：PCR儀指示溫度與實際溫度是否相符，過高酶在前幾個循環就迅速失活；過低則模板變性不徹底。反應系統中污染了蛋白酶及核酸酶，應在未加Taq酶以前，將反應體系95℃加熱5-10 min。引物變質失效。人工合成的引物是否正確。是否純化，或因儲存條件不當而失活。引物錯誤。利用BLAST檢查引物特異性或重新設計引物。 DNA凝膠電泳時加入陽性對照，確保不是DNA凝膠和PCR程序的問題。聚合酶鏈反應很容易理解和使用，并迅速產生結果。武漢實時RT-PCR檢測技術研究方案

像所有酶一樣，DNA聚合酶也容易出錯，這反過來會導致產生的PCR片段發生突變。武漢實時RT-PCR檢測技術研究方案

中國銷售產業憑借獨特資源和市場優勢，一舉成為資本角逐的重點領域之一。從世界范圍來看，美、歐、日等發達地區的銷售產業發展歷史悠久，無論是銷售產品制造業還是銷售服務業，都處于全球優先地位。從世界范圍來看，美、歐、日等發達地區的銷售產業發展歷史悠久，無論是銷售產品制造業還是銷售服務業，都處于全球優先地位。而泰國、印度等東南亞及南亞地區，銷售產業雖然起步晚，但是發展較快，已成為經濟社會發展重要組成部分。服務型項目新市場加入通常耗資巨大，單一的資本進入往往會形成極大的資本壓力，因此一些重大的服務型項目往往都會通過數家有實力的資本進行組合資本。美國銷售產業與中國有所不同，和美國相比，中國的產業仍處于初創期。在經濟新常態下，中國大銷售產業憑借獨特資源和市場優勢，一舉成為資本角逐的重點領域之一。有關機構預測，中國銷售產業規模未來5年年均復合增長率約為27.26%。武漢實時RT-PCR檢測技術研究方案

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