低溫冷凍透射電鏡技術(shù)的特點(diǎn)：相對(duì)于常溫透射電鏡，低溫透射電鏡的優(yōu)勢(shì)有：①快速冷凍制樣技術(shù)將樣品固定在玻璃態(tài)的冰層中，避免了水或溶劑結(jié)晶對(duì)樣品結(jié)構(gòu)的破壞，能夠保持液相中有機(jī)分子自組裝體和化學(xué)反應(yīng)中間體的微觀結(jié)構(gòu)，避免了樣品干燥引起的結(jié)構(gòu)變化;②高分子及化學(xué)反應(yīng)體系常常具有非平衡態(tài)結(jié)構(gòu)，快速冷凍制樣技術(shù)能夠保持住非平衡態(tài)結(jié)構(gòu)，進(jìn)而得以觀察;③低溫條件能夠盡可能保持有機(jī)和高分子等軟物質(zhì)材料的微觀結(jié)構(gòu)，明顯減少電子束對(duì)樣品的損傷。冷凍電鏡技術(shù)也正在成為助力醫(yī)藥研發(fā)的有力手段。南通透射電鏡技術(shù)原理

為什么要做冷凍透射電子顯微鏡技術(shù)服務(wù)？a.反應(yīng)樣品溶液里結(jié)構(gòu)：如有機(jī)分子組裝成的微球、囊泡、膠束、納米管、片層、水凝膠結(jié)構(gòu)等（往往一般透射拍攝到的都是溶液揮發(fā)干了之后的結(jié)構(gòu)，但是這樣的結(jié)構(gòu)無(wú)論是形貌和尺寸和溶液里都有一定差別，現(xiàn)在好多文章的審稿意見(jiàn)都會(huì)需要這類(lèi)結(jié)構(gòu)的透射照片在溶液里的真實(shí)形貌，說(shuō)簡(jiǎn)單了就是讓補(bǔ)一個(gè)冷凍透射）；b.不穩(wěn)定的納米結(jié)構(gòu)：比如經(jīng)不起強(qiáng)電子束照射的樣品（MOF、COF等若相互作用力結(jié)合的材料，如金屬配位、氫鍵相互作用、親疏水作用力、ππ堆疊等）在強(qiáng)電子束照射下結(jié)構(gòu)會(huì)坍塌，冷凍電鏡全程在-160℃下可以做到對(duì)樣品損害較小；c.生物類(lèi)分子好多都需要冷凍，因?yàn)樯锓肿颖旧矶夹枰谒蛘哐旱却婊睿恍┥飿悠窐?gòu)筑的一些納米結(jié)構(gòu)，如納米微球、囊泡、膜、多孔材料等等。南通透射電鏡技術(shù)原理冷凍電子顯微鏡技術(shù)還將普遍應(yīng)用于細(xì)胞組織的超微結(jié)構(gòu)解析，對(duì)解開(kāi)生命活動(dòng)的規(guī)律和機(jī)制等產(chǎn)生更大影響。

單顆粒冷凍電鏡技術(shù)的顆粒挑選：接下來(lái)需要從原始數(shù)據(jù)中篩選出顆粒投影，也被稱(chēng)為“顆粒挑選”，顆粒挑選的好壞也將影響所有后續(xù)的分析和處理過(guò)程，是一個(gè)重要并且繁瑣的步驟。顆粒挑選方式可以分為手動(dòng)挑選、半自動(dòng)挑選和完全自動(dòng)挑選這幾種。在早期的分析中，對(duì)于結(jié)構(gòu)的了解還非常少，優(yōu)先考慮的都是人工挑選。但是自動(dòng)的顆粒圖像獲取方法的出現(xiàn)使得在很短時(shí)間內(nèi)可以收集數(shù)十萬(wàn)張顆粒圖像，人工挑選大量的顆粒圖像不太現(xiàn)實(shí)，并且人工的挑選通常會(huì)過(guò)于集中于某一類(lèi)顆粒圖像，導(dǎo)致遺漏和偏差。半自動(dòng)和全自動(dòng)的方法主要有以下三類(lèi)：(1)通過(guò)例如降噪、反襯增強(qiáng)、邊緣算子等圖像形態(tài)學(xué)方法搜索區(qū)域，基于數(shù)字圖像處理學(xué)的原理，將顆粒圖像與背景分離開(kāi)來(lái)。(2)基于模板的方法，通過(guò)掃描數(shù)據(jù)圖像和已知的模板比較來(lái)挑選出潛在的顆粒圖像，模板的來(lái)源通常為手動(dòng)選出的數(shù)據(jù)圖像中較為清晰的顆粒圖像，或者是已知結(jié)構(gòu)的投影。(3)結(jié)合無(wú)模板和有模板的方法，通過(guò)一些有監(jiān)督的機(jī)器學(xué)習(xí)算法進(jìn)行顆粒挑選。

冷凍電鏡技術(shù)之冷凍蝕刻電子顯微鏡：冷凍蝕刻電鏡技術(shù)是從50年代開(kāi)始發(fā)展起來(lái)的一種將斷裂和復(fù)型相結(jié)合的制備透射電鏡樣品技術(shù)，亦稱(chēng)冷凍斷裂或冷凍復(fù)型，用于細(xì)胞生物學(xué)等領(lǐng)域的顯微結(jié)構(gòu)研究。冷凍蝕刻電鏡的優(yōu)點(diǎn)：①樣品通過(guò)冷凍，可使其微細(xì)結(jié)構(gòu)接近于活的狀態(tài);②樣品經(jīng)冷凍斷裂蝕刻后，能夠觀察到不同劈裂面的微細(xì)結(jié)構(gòu)，進(jìn)而可研究細(xì)胞內(nèi)的膜性結(jié)構(gòu)及內(nèi)含物結(jié)構(gòu);③冷凍蝕刻的樣品，經(jīng)鉑、碳噴鍍而制備的復(fù)型膜，具有很強(qiáng)的立體感且能耐受電子束轟擊和長(zhǎng)期保存。冷凍電鏡技術(shù)既完美契合了結(jié)構(gòu)生物學(xué)的基礎(chǔ)研究，又能夠助力加速基于結(jié)構(gòu)的藥物研發(fā)。

冷凍電鏡技術(shù)工作流程：做好前面的工作就需要設(shè)定較佳的參數(shù)（比如：欠焦值、放大倍數(shù)和電子劑量等），記錄這些樣品區(qū)域的大量圖像，用手工或半自動(dòng)程序框取那些離散的分子形成的投影圖。然后就是三維結(jié)構(gòu)搭建。由于電子可能對(duì)非常敏感的樣品造成輻射損傷，所以單顆粒冷凍電鏡只能采用非常低的電子量，而這種電鏡2D投影圖像有非常大的背景噪聲。為提高圖像分辨率，研究人員首先需要提出一個(gè)初始的3D模型，然后對(duì)捕獲的單顆粒2D圖像進(jìn)行分選。冷凍電鏡技術(shù)之冷凍蝕刻電子顯微鏡優(yōu)點(diǎn)：可研究細(xì)胞內(nèi)的膜性結(jié)構(gòu)及內(nèi)含物結(jié)構(gòu)。南通透射電鏡技術(shù)原理

冷凍電子顯微技術(shù)學(xué)解析生物大分子及細(xì)胞結(jié)構(gòu)的中心是透射電子顯微鏡成像。南通透射電鏡技術(shù)原理

單顆粒冷凍電鏡技術(shù)：生物大分子快速冷凍后，在低溫下利用透射電子顯微鏡對(duì)結(jié)構(gòu)均一、分散的全同樣品顆粒進(jìn)行成像，再經(jīng)圖像處理及重構(gòu)計(jì)算獲得樣品的三維結(jié)構(gòu)。可研究生物大分子在溶液中的結(jié)構(gòu)及構(gòu)象變化、無(wú)需結(jié)晶、所需樣品量相對(duì)較少，適合于蛋白質(zhì)、病毒等生物大分子及其復(fù)合物的結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究。樣品制備：可以根據(jù)樣品、電鏡載網(wǎng)和其他使用條件，摸索合適的單顆粒樣品制備條件，純化、收集濃度范圍從幾微升50nM至5uM濃度的蛋白溶液來(lái)制備單顆粒電鏡樣品。在-196℃時(shí)，組織中的生物大分子能夠長(zhǎng)期保持穩(wěn)定性、細(xì)胞活性及組織微觀結(jié)構(gòu)，同時(shí)，在低溫下，生物樣品耐受電子輻照劑量增強(qiáng)，且其在電鏡鏡筒的高真空環(huán)境中脫水變形的問(wèn)題也得以解決。Vitrobot和EMGP2均能夠提供快速、簡(jiǎn)單、可重復(fù)的安自動(dòng)化樣品玻璃化制備過(guò)程，其在恒定的物理和機(jī)械條件下（如溫度、相對(duì)濕度、吸濕條件和冷凍速度）對(duì)樣品進(jìn)行冷凍固定確保生物樣品在低溫狀態(tài)下仍保持天然構(gòu)象。南通透射電鏡技術(shù)原理

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