冷凍電子顯微技術(shù)的發(fā)展與完善經(jīng)歷了復(fù)雜而艱辛的探索，下面，我們將深入解析冷凍電子顯微鏡的工作原理、流程與儀器結(jié)構(gòu)，揭開它的廬山真面目。樣品制備：樣品快速冷凍技術(shù)：樣品的原位冷凍固定處理是低溫電子顯微鏡標(biāo)本制備的開始。冷凍電鏡采用的快速冷凍技術(shù)關(guān)鍵在于“快速”。這是由于：采用常規(guī)冷凍手段，水分子會(huì)在氫鍵作用下形成冰晶，一來會(huì)改變樣品結(jié)構(gòu)，二來在成像過程中，冰晶體會(huì)產(chǎn)生強(qiáng)烈的電子衍射掩蓋樣品信號(hào)。而當(dāng)冷凍速率足夠快時(shí)，水分子在形成晶體之前就會(huì)凝固成無定形的玻璃態(tài)冰，具有非晶態(tài)特性，保證了在電子束探測(cè)成像的過程中不會(huì)對(duì)樣品成像造成干擾。冷凍固定時(shí)，樣品首先放置在由液氮冷卻的容器中，隨后被快速浸入液態(tài)乙烷中。采用液態(tài)乙烷作為冷凍劑的目的是為了使冷凍速率足夠快，在冷凍過程中，樣品將以每秒104至106K的速度被快速冷卻。生物樣品中的水被玻璃化冷凍后，樣品結(jié)構(gòu)就得到了保持和固定，同時(shí)玻璃化冰也不會(huì)在真空環(huán)境中揮發(fā)，在一定程度上保護(hù)了樣品免受電子輻射的損傷。冷凍電鏡技術(shù)之冷凍透射電鏡是將樣品冷卻到液氮溫度，用于觀測(cè)蛋白、生物切片等對(duì)溫度敏感的樣品。湖州原位冷凍電鏡技術(shù)服務(wù)電話

單顆粒冷凍電鏡技術(shù)：生物大分子快速冷凍后，在低溫下利用透射電子顯微鏡對(duì)結(jié)構(gòu)均一、分散的全同樣品顆粒進(jìn)行成像，再經(jīng)圖像處理及重構(gòu)計(jì)算獲得樣品的三維結(jié)構(gòu)。可研究生物大分子在溶液中的結(jié)構(gòu)及構(gòu)象變化、無需結(jié)晶、所需樣品量相對(duì)較少，適合于蛋白質(zhì)、病毒等生物大分子及其復(fù)合物的結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究。樣品制備：可以根據(jù)樣品、電鏡載網(wǎng)和其他使用條件，摸索合適的單顆粒樣品制備條件，純化、收集濃度范圍從幾微升50nM至5uM濃度的蛋白溶液來制備單顆粒電鏡樣品。在-196℃時(shí)，組織中的生物大分子能夠長(zhǎng)期保持穩(wěn)定性、細(xì)胞活性及組織微觀結(jié)構(gòu)，同時(shí)，在低溫下，生物樣品耐受電子輻照劑量增強(qiáng)，且其在電鏡鏡筒的高真空環(huán)境中脫水變形的問題也得以解決。Vitrobot和EMGP2均能夠提供快速、簡(jiǎn)單、可重復(fù)的安自動(dòng)化樣品玻璃化制備過程，其在恒定的物理和機(jī)械條件下（如溫度、相對(duì)濕度、吸濕條件和冷凍速度）對(duì)樣品進(jìn)行冷凍固定確保生物樣品在低溫狀態(tài)下仍保持天然構(gòu)象。湖州原位冷凍電鏡技術(shù)服務(wù)電話冷凍電鏡技術(shù)中的單顆粒分析法的研究對(duì)象可以是具有某種對(duì)稱性的顆粒，也可不具有任何對(duì)稱性的蛋白分子。

冷凍電鏡技術(shù)近年來獲得了迅猛的發(fā)展，取得了許多具有重大意義的成果。冷凍電鏡將生物分子進(jìn)行冷凍便可進(jìn)行高分辨率成像，還具有分辨率高、更接近天然狀態(tài)、適用研究對(duì)象普遍等優(yōu)勢(shì)。同時(shí)，系統(tǒng)地綜述了冷凍電鏡技術(shù)在科學(xué)研究中的應(yīng)用，并展望冷凍電鏡技術(shù)未來的發(fā)展。冷凍電鏡（cryo-electronmicroscopy，cryo-EM）技術(shù)，是在低溫下使用透射電子顯微鏡觀察樣品的顯微技術(shù)，即把樣品冷凍并保持低溫放進(jìn)顯微鏡里面，用高度相干的電子作為光源從上面照射，透過樣品和附近的冰層，受到散射，再利用探測(cè)器和透鏡系統(tǒng)把散射信號(hào)成像記錄下來，較后進(jìn)行信號(hào)處理，得到樣品的結(jié)構(gòu)。

冷凍電鏡技術(shù)揭示生物分子細(xì)節(jié)：在透射電子顯微鏡下，高能電子束穿透每一個(gè)分子，如同X光穿過人的身體一樣，可以拍攝到分子的形貌和它內(nèi)部的結(jié)構(gòu)信息。科學(xué)家們利用計(jì)算機(jī)將樣本里的每一個(gè)分子提取出來，把相似的分子予以歸類，然后疊加、平均獲得其內(nèi)部結(jié)構(gòu)更為精細(xì)的圖像，由此得到分子不同方向的二維結(jié)構(gòu)，較后經(jīng)過計(jì)算機(jī)三維重構(gòu)算法，可以得到分子的三維模型。這一過程被稱為冷凍電鏡三維重構(gòu)解析。冷凍電鏡技術(shù)的發(fā)展，使得現(xiàn)在的人類可以對(duì)細(xì)胞內(nèi)的生命活動(dòng)有更多了解。未來，科學(xué)家將借助冷凍電鏡技術(shù)繼續(xù)對(duì)復(fù)雜生命體的解讀。基于結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計(jì)已經(jīng)逐漸成為藥物開發(fā)設(shè)計(jì)的主流，與此同時(shí)冷凍電鏡技術(shù)也在蓬勃發(fā)展。

冷凍電鏡技術(shù)原理之單顆粒技術(shù)：對(duì)分散分布的生物大分子分別成像，基于分子結(jié)構(gòu)同一性的假設(shè)，對(duì)多個(gè)圖像進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并通過對(duì)正、加和平均等圖像操作手段提高信噪比，進(jìn)一步確認(rèn)二維圖像之間的空間投影關(guān)系后經(jīng)過三維重構(gòu)獲得生物大分子的三維結(jié)構(gòu)方法。其適合的樣品分子量范圍為80~50MD，Zgao分辨率約0.3nm。利用單顆粒技術(shù)獲得三維重構(gòu)的方法主要包括等價(jià)線方法、隨機(jī)圓錐重構(gòu)法、隨機(jī)初始模型迭代收斂重構(gòu)等方法，其基本目標(biāo)是獲得二維圖像之間正確的空間投影關(guān)系，從而進(jìn)行三維重構(gòu)。冷凍電鏡技術(shù)具有更接近天然狀態(tài)、適用研究對(duì)象普遍等優(yōu)勢(shì)。湖州原位冷凍電鏡技術(shù)服務(wù)電話

冷凍電鏡技術(shù)就是在傳統(tǒng)透射電子顯微鏡之上，加上了低溫傳輸系統(tǒng)和冷凍防污染系統(tǒng)。湖州原位冷凍電鏡技術(shù)服務(wù)電話

冷凍電鏡技術(shù)基本原理之電鏡三維重構(gòu)理論：D.DeRosier和A.Klug提出三維重構(gòu)理論是借助一系列沿不同方向投影的電子顯微像來重構(gòu)被測(cè)物體的立體構(gòu)型，利用計(jì)算機(jī)數(shù)字圖像處理技術(shù)進(jìn)行電子顯微像三維重構(gòu)測(cè)定生物大分子結(jié)構(gòu)的概念和方法。透射電子顯微鏡成像過程中，電子束穿透樣品，將樣品的三維電勢(shì)密度分布函數(shù)沿著電子束的傳播方向投影至與傳播方向垂直的二維平面上。運(yùn)用中心截面定理，從而可以通過三維物體不同角度的二維投影在計(jì)算機(jī)內(nèi)進(jìn)行三維重構(gòu)來解析獲得物體的三維結(jié)構(gòu)。湖州原位冷凍電鏡技術(shù)服務(wù)電話