冷凍電鏡技術(shù)揭示生物分子細(xì)節(jié)：科學(xué)家在透射電子顯微鏡之上發(fā)明了冷凍電鏡，實現(xiàn)了生物分子“近原子級”的分辨率，讓人類終于可以一窺究竟生物分子是如何執(zhí)行其功能。在過去幾年里，冷凍電子顯微鏡技術(shù)逐漸成為結(jié)構(gòu)生物學(xué)的重要研究工具。冷凍電鏡技術(shù)的基本原理是將生物大分子溶液置于電鏡載網(wǎng)上形成一層非常薄的水膜，然后利用快速冷凍技術(shù)將其瞬間冷凍至液氮溫度下。冷凍速度非?？欤灾劣谒o法形成晶體，而是形成一層玻璃態(tài)的冰。生物大分子就被固定在這層薄冰里。將這樣的冷凍樣品保持低溫放置在透射電子顯微鏡下觀察，從而獲得生物大分子的結(jié)構(gòu)，被稱為冷凍電鏡技術(shù)。冷凍電鏡技術(shù)的獨(dú)特優(yōu)勢：冷凍電鏡單粒子法既可以對具有對稱結(jié)構(gòu)的大分子進(jìn)行研究。武漢低溫冷凍透射電子顯微鏡技術(shù)哪里有

冷凍電鏡技術(shù)解析結(jié)構(gòu)的一般流程是怎樣的？對樣品的要求是什么？冷凍電鏡解析蛋白結(jié)構(gòu)一般流程為：蛋白表達(dá)純化；負(fù)染樣品準(zhǔn)備：約2小時完成；負(fù)染樣品的數(shù)據(jù)收集：約8小時完成；冷凍樣品的準(zhǔn)備：約4小時完成；冷凍樣品的數(shù)據(jù)收集：48-120小時完成。三維結(jié)構(gòu)重建。冷凍電鏡解析蛋白結(jié)構(gòu)對蛋白質(zhì)的要求：分子量：一般需要樣品的分子量在200kD以上。緩沖液：緩沖液中不能含有多糖，DMSO，甘油等有機(jī)物質(zhì)，這些會降低樣品的襯度，難以獲得高分辨的三維結(jié)構(gòu)。一般而言，緩沖液為20mMHepes，150mMNaCl。濃度：一般而言，可溶性蛋白濃度應(yīng)在1mg/ml左右，膜蛋白應(yīng)保證濃度在5mg/ml左右。體積：20ul足夠（前提是需要蛋白濃度達(dá)標(biāo)，做一個樣品3ul左右）。均一性：分子篩行為表現(xiàn)為單一的峰，均一性大于90%。武漢低溫冷凍透射電子顯微鏡技術(shù)哪里有冷凍電鏡技術(shù)中的單顆粒分析法理論成像分辨率更高。

冷凍電鏡技術(shù)之冷凍掃描電鏡：掃描電鏡工作者都面臨著一個不能回避的事實，就是所有生命科學(xué)以及許多材料科學(xué)的樣品都含有液體成分。很多動植物組織的含水量達(dá)到98%，這是掃描電鏡工作者比較難對付的樣品問題。冷凍掃描電鏡(Cryo-SEM)技術(shù)是克服樣品含水問題的一個快速、可靠和有效的方法。這種技術(shù)還被普遍地用于觀察一些“困難”樣品，如那些對電子束敏感的具有不穩(wěn)定性的樣品。各種高壓模式如VP、LVESEM的出現(xiàn)，已允許掃描電鏡觀察未經(jīng)冷凍和干燥的樣品。但是，冷凍掃描電鏡仍然是防止樣品丟失水分的Z有效方法，它能應(yīng)用于任何真空狀態(tài)，包括裝于掃描電鏡的Peltier臺以及向樣品室內(nèi)沖以水汽的裝置。冷凍掃描電鏡還有一些其他優(yōu)點(diǎn)，如具有冷凍斷裂的能力以及可以通過控制樣品升華刻蝕來選擇性地去除表面水分(冰)等。

單顆粒冷凍電鏡技術(shù)二維圖像分析——顆粒圖像的匹配與分類：二維顆粒圖像的分類是獲取三維結(jié)構(gòu)過程的第一步。對二維圖像的分析包括兩部分：顆粒圖像的匹配和顆粒圖像的分類。匹配的過程通常會對顆粒圖像應(yīng)用一些變換操作，通過關(guān)聯(lián)函數(shù)去判斷不同顆粒圖像之間的相似程度。圖像匹配的算法主要分為兩種，即不依賴模型的方法和基于模型的方法，取決于是否存在利用樣本先驗信息得到的模板。隨著圖像匹配的完成，顆粒圖像需要進(jìn)行分類。主要利用多元統(tǒng)計分析和主成分分析方法等算法，其他流行的二維顆粒分類技術(shù)還有神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)分類，將圖像在二維空間自組織映射(self-organisingmapping，SOM)再進(jìn)行分類和排序。二維圖像分析的目的是，首先通過圖像匹配消除旋轉(zhuǎn)和平移的誤差，利用類內(nèi)緊致、類間離散的原則進(jìn)行圖像分類，較終可以對類內(nèi)顆粒圖像進(jìn)行平均，提高信噪比，從而實現(xiàn)對高分辨率三維結(jié)構(gòu)的構(gòu)建。主要使用的幾種冷凍電子顯微學(xué)技術(shù)結(jié)構(gòu)解析方法包括：電子晶體學(xué)、單顆粒重構(gòu)技術(shù)、電子斷層掃描等。

冷凍電子顯微鏡技術(shù)中電子斷層掃描重構(gòu)技術(shù)：電子斷層掃描技術(shù)是從一個物體的投影圖像重構(gòu)獲得物體內(nèi)部結(jié)構(gòu)的技術(shù)，通過獲取同一物體的多個連續(xù)角度下的二維投影圖來反向重構(gòu)它的三維結(jié)構(gòu)。簡單地說，電子斷層掃描技術(shù)就是將一個物體(樣品)沿著一個與電子束垂直的軸旋轉(zhuǎn)，每旋轉(zhuǎn)一個角度，采集這個物體在相對應(yīng)方向上的二維投影像，通過對這些二維投影圖的處理(相互配準(zhǔn))，將不同角度的二維投影圖反向重構(gòu)(如加權(quán)背投影等方法)，獲得樣品整體三維結(jié)構(gòu)的技術(shù)。電子斷層成像適合于在納米級尺度上研究不具有結(jié)構(gòu)均一性的蛋白、病毒、細(xì)胞器以及它們之間組成的復(fù)合體的三維結(jié)構(gòu)。與電子晶體學(xué)和單顆粒技術(shù)相比，這種技術(shù)無需樣品顆粒具有結(jié)構(gòu)同一性，也不強(qiáng)調(diào)樣品具有一定的對稱性。因此，雖然目前電子斷層成像所獲得的結(jié)構(gòu)的分辨率(約4~10納米)不能與以上兩種技術(shù)相比，但其在研究非定形、不對稱和不具全同性的生物樣品的三維結(jié)構(gòu)和功能中有著不可替代的作用。冷凍電鏡技術(shù)助力快速、高效的新藥研發(fā)。武漢低溫冷凍透射電子顯微鏡技術(shù)哪里有

冷凍電子顯微技術(shù)主要包括單顆粒冷凍電鏡技術(shù)和冷凍電子斷層掃描技術(shù)。武漢低溫冷凍透射電子顯微鏡技術(shù)哪里有

冷凍電子顯微鏡技術(shù)步驟之圖像采集：冷凍的樣品通過專門的設(shè)備一冷凍輸送器轉(zhuǎn)移到電鏡的樣品室。在照相之前，必須觀察樣品中的水是否處于玻璃態(tài)，如果不是則應(yīng)重新制備樣品。由于生物樣品對高能電子的輻射敏感，照相時必須使用較小曝光技術(shù)。經(jīng)過透射電子顯微鏡中一系列復(fù)雜的過程，較終在記錄介質(zhì)上會形成樣品放大幾千倍至幾十萬倍的圖像。利用計算機(jī)對這些放大的圖像進(jìn)行處理分析即可獲得樣品的精細(xì)結(jié)構(gòu)。近年來，一個技術(shù)上的重大突破是高分辨率圖像采集設(shè)備的開發(fā)與應(yīng)用?；诨パa(bǔ)金屬氧化物半導(dǎo)體(CMOS)技術(shù)開發(fā)的直接探測電子成像的裝置使電子顯微放大圖像的信噪比相對過去所使用的底片或電荷耦合元件(CCD)有了很大提高、進(jìn)而提高了成像的質(zhì)量。武漢低溫冷凍透射電子顯微鏡技術(shù)哪里有