冷凍電鏡技術解析結構的一般流程是怎樣的？對樣品的要求是什么？冷凍電鏡解析蛋白結構一般流程為：蛋白表達純化；負染樣品準備：約2小時完成；負染樣品的數據收集：約8小時完成；冷凍樣品的準備：約4小時完成；冷凍樣品的數據收集：48-120小時完成。三維結構重建。冷凍電鏡解析蛋白結構對蛋白質的要求：分子量：一般需要樣品的分子量在200kD以上。緩沖液：緩沖液中不能含有多糖，DMSO，甘油等有機物質，這些會降低樣品的襯度，難以獲得高分辨的三維結構。一般而言，緩沖液為20mMHepes，150mMNaCl。濃度：一般而言，可溶性蛋白濃度應在1mg/ml左右，膜蛋白應保證濃度在5mg/ml左右。體積：20ul足夠（前提是需要蛋白濃度達標，做一個樣品3ul左右）。均一性：分子篩行為表現為單一的峰，均一性大于90%。冷凍電鏡技術既完美契合了結構生物學的基礎研究，又能夠助力加速基于結構的藥物研發。南京冷凍電鏡單顆粒技術服務電話

冷凍電鏡技術總結：電子斷層成像技術則可用來研究一定厚度的亞細胞器在天然狀態下的內部結構，由于樣品厚度的限制，能看到500-1000nm左右厚度的結構，的也可以了解整個細胞不同層面的內部結構.盡管，我們能夠預言按目前電子冷凍斷層成像技術的發展會得到許多更誘人的信息。細胞內存在大量分子機器和生物大分子復合物，并且與單個超分子相比要大，更容易對其進行識別。這樣的事實使斷層技術的目標變得簡單了。在不久的將來關于細胞骨架，核孔復合體和核纖層，囊泡聚集和運輸復合物以及其他一些細胞成分的一些基本問題會得到更清晰的闡釋。這兩種方法都不需要對樣品進行結晶，快速含水冰凍的制樣過程既不復雜，又保存了樣品的瞬時天然結構，有利于對復合物的功能進行研究，圖像自動化篩選過程將是今后提高分辨率的關鍵環節。而電子晶體學則對具有對稱結構的樣品進行三維重構具有很大的優勢，比如二十面體病毒，螺旋對稱結構等，尤其適合膜蛋白的三維結構，并且是電子顯微術中目前只一能達到原子分辨率水平的方法。南京冷凍電鏡單顆粒技術服務電話冷凍電鏡技術中單顆粒分析法優點：樣品受總輻射值小；對稱顆粒的解析分辨率更高。

冷凍電子顯微鏡技術中電子斷層掃描重構技術：電子斷層掃描技術是從一個物體的投影圖像重構獲得物體內部結構的技術，通過獲取同一物體的多個連續角度下的二維投影圖來反向重構它的三維結構。簡單地說，電子斷層掃描技術就是將一個物體(樣品)沿著一個與電子束垂直的軸旋轉，每旋轉一個角度，采集這個物體在相對應方向上的二維投影像，通過對這些二維投影圖的處理(相互配準)，將不同角度的二維投影圖反向重構(如加權背投影等方法)，獲得樣品整體三維結構的技術。電子斷層成像適合于在納米級尺度上研究不具有結構均一性的蛋白、病毒、細胞器以及它們之間組成的復合體的三維結構。與電子晶體學和單顆粒技術相比，這種技術無需樣品顆粒具有結構同一性，也不強調樣品具有一定的對稱性。因此，雖然目前電子斷層成像所獲得的結構的分辨率(約4~10納米)不能與以上兩種技術相比，但其在研究非定形、不對稱和不具全同性的生物樣品的三維結構和功能中有著不可替代的作用。

冷凍電鏡技術的應用情況：近年來，冷凍電鏡技術在全球范圍被大眾所熟知，并且被越來越多的學術界和跨國制藥企業所采用。在藥物研發方面，多個跨國公司已經將冷凍電鏡技術用于藥物發現。雖然冷凍電鏡技術屬于前沿技術，但目前已經有利用冷凍電鏡基于結構研發的藥物進入臨床試驗。冷凍電鏡技術在藥品開發過程中的應用實例，進一步說明該技術在藥品（生物制品）的質量方面有前瞻性的意義。在回顧技術應用的同時，也看到了未來冷凍電鏡技術在新藥研發方面的幾個前瞻方向。我們相信冷凍電鏡在基于結構的藥物設計、生物制劑高級結構表征、冷鏈運輸過程中的質量控制中將發揮越來越重要的作用。冷凍電子顯微鏡技術還將普遍應用于細胞組織的超微結構解析，對解開生命活動的規律和機制等產生更大影響。

冷凍電子顯微鏡技術步驟之樣品制備：用于冷凍電鏡研究的生物樣品必須非常純凈。生物樣品是在高真空的條件下成像的，所以樣品的制備既要能夠保持本身的結構又能抗脫水、電子輻射。現在普遍采用的方法是通過快速冷凍使含水樣品中的水處于玻璃態，也就是在親水的支持膜上將含水樣品包埋在一層較樣品略高的薄冰內。冰的結構多種多樣，包括六角形冰、立方體冰等，其物理狀態與冷凍速率有關。若要形成玻璃態(即無定形態)的冰，需要冷凍速率達到每秒鐘104攝氏度。此時，冰的結構呈現各向同性，不會因成像角度不同而導致圖像產生偏差。該方法有兩個步驟:一是將樣品在載網上形成一薄層水膜:二是將第步獲得的含水薄膜樣品快速冷凍。在多數情況下，用手工將載網迅速浸入液氮內可使水冷凍成為玻璃態。其優點在于將樣品保持在接近生活狀態，不會因脫水而變形，同時可以減少輻射損傷。冷凍電鏡技術主要研究組織、細胞和微生物中的超微結構。南京冷凍電鏡單顆粒技術服務電話

冷凍電鏡技術的研究，主要是冷凍成像和蛋白快速冷凍技術。南京冷凍電鏡單顆粒技術服務電話

單顆粒冷凍電鏡技術的圖像處理技術：經過多年的發展，目前冷凍電鏡的數據處理部分主要包含了以下的流程：(1)襯度傳遞函數的修正(CTFcorrection)；(2)樣品分子投影數據的篩選(particleselection)；(3)二維投影數據的分類和降噪(2Danalysis)；(4)三維模型的重構和優化(3Dreconstructionandrefinement)；(5)多重構象的結構分析(heterogeneityanalysis)；(6)對重建結構分辨率的分析(structureresolutionassessment)；(7)結合生物化學原理和實驗數據對三維結構的解讀(modelinterpretationandvalidation)。南京冷凍電鏡單顆粒技術服務電話