冷凍電鏡技術(shù)解析結(jié)構(gòu)的一般流程是怎樣的?對樣品的要求是什么?冷凍電鏡解析蛋白結(jié)構(gòu)一般流程為:蛋白表達(dá)純化;負(fù)染樣品準(zhǔn)備:約2小時完成;負(fù)染樣品的數(shù)據(jù)收集:約8小時完成;冷凍樣品的準(zhǔn)備:約4小時完成;冷凍樣品的數(shù)據(jù)收集:48-120小時完成。三維結(jié)構(gòu)重建。冷凍電鏡解析蛋白結(jié)構(gòu)對蛋白質(zhì)的要求:分子量:一般需要樣品的分子量在200kD以上。緩沖液:緩沖液中不能含有多糖,DMSO,甘油等有機(jī)物質(zhì),這些會降低樣品的襯度,難以獲得高分辨的三維結(jié)構(gòu)。一般而言,緩沖液為20mMHepes,150mMNaCl。濃度:一般而言,可溶性蛋白濃度應(yīng)在1mg/ml左右,膜蛋白應(yīng)保證濃度在5mg/ml左右。體積:20ul足夠(前提是需要蛋白濃度達(dá)標(biāo),做一個樣品3ul左右)。均一性:分子篩行為表現(xiàn)為單一的峰,均一性大于90%。冷凍電鏡技術(shù)既完美契合了結(jié)構(gòu)生物學(xué)的基礎(chǔ)研究,又能夠助力加速基于結(jié)構(gòu)的藥物研發(fā)。南京冷凍電鏡單顆粒技術(shù)服務(wù)電話
冷凍電鏡技術(shù)總結(jié):電子斷層成像技術(shù)則可用來研究一定厚度的亞細(xì)胞器在天然狀態(tài)下的內(nèi)部結(jié)構(gòu),由于樣品厚度的限制,能看到500-1000nm左右厚度的結(jié)構(gòu),的也可以了解整個細(xì)胞不同層面的內(nèi)部結(jié)構(gòu).盡管,我們能夠預(yù)言按目前電子冷凍斷層成像技術(shù)的發(fā)展會得到許多更誘人的信息。細(xì)胞內(nèi)存在大量分子機(jī)器和生物大分子復(fù)合物,并且與單個超分子相比要大,更容易對其進(jìn)行識別。這樣的事實(shí)使斷層技術(shù)的目標(biāo)變得簡單了。在不久的將來關(guān)于細(xì)胞骨架,核孔復(fù)合體和核纖層,囊泡聚集和運(yùn)輸復(fù)合物以及其他一些細(xì)胞成分的一些基本問題會得到更清晰的闡釋。這兩種方法都不需要對樣品進(jìn)行結(jié)晶,快速含水冰凍的制樣過程既不復(fù)雜,又保存了樣品的瞬時天然結(jié)構(gòu),有利于對復(fù)合物的功能進(jìn)行研究,圖像自動化篩選過程將是今后提高分辨率的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。而電子晶體學(xué)則對具有對稱結(jié)構(gòu)的樣品進(jìn)行三維重構(gòu)具有很大的優(yōu)勢,比如二十面體病毒,螺旋對稱結(jié)構(gòu)等,尤其適合膜蛋白的三維結(jié)構(gòu),并且是電子顯微術(shù)中目前只一能達(dá)到原子分辨率水平的方法。南京冷凍電鏡單顆粒技術(shù)服務(wù)電話冷凍電鏡技術(shù)中單顆粒分析法優(yōu)點(diǎn):樣品受總輻射值小;對稱顆粒的解析分辨率更高。
冷凍電子顯微鏡技術(shù)中電子斷層掃描重構(gòu)技術(shù):電子斷層掃描技術(shù)是從一個物體的投影圖像重構(gòu)獲得物體內(nèi)部結(jié)構(gòu)的技術(shù),通過獲取同一物體的多個連續(xù)角度下的二維投影圖來反向重構(gòu)它的三維結(jié)構(gòu)。簡單地說,電子斷層掃描技術(shù)就是將一個物體(樣品)沿著一個與電子束垂直的軸旋轉(zhuǎn),每旋轉(zhuǎn)一個角度,采集這個物體在相對應(yīng)方向上的二維投影像,通過對這些二維投影圖的處理(相互配準(zhǔn)),將不同角度的二維投影圖反向重構(gòu)(如加權(quán)背投影等方法),獲得樣品整體三維結(jié)構(gòu)的技術(shù)。電子斷層成像適合于在納米級尺度上研究不具有結(jié)構(gòu)均一性的蛋白、病毒、細(xì)胞器以及它們之間組成的復(fù)合體的三維結(jié)構(gòu)。與電子晶體學(xué)和單顆粒技術(shù)相比,這種技術(shù)無需樣品顆粒具有結(jié)構(gòu)同一性,也不強(qiáng)調(diào)樣品具有一定的對稱性。因此,雖然目前電子斷層成像所獲得的結(jié)構(gòu)的分辨率(約4~10納米)不能與以上兩種技術(shù)相比,但其在研究非定形、不對稱和不具全同性的生物樣品的三維結(jié)構(gòu)和功能中有著不可替代的作用。
冷凍電鏡技術(shù)的應(yīng)用情況:近年來,冷凍電鏡技術(shù)在全球范圍被大眾所熟知,并且被越來越多的學(xué)術(shù)界和跨國制藥企業(yè)所采用。在藥物研發(fā)方面,多個跨國公司已經(jīng)將冷凍電鏡技術(shù)用于藥物發(fā)現(xiàn)。雖然冷凍電鏡技術(shù)屬于前沿技術(shù),但目前已經(jīng)有利用冷凍電鏡基于結(jié)構(gòu)研發(fā)的藥物進(jìn)入臨床試驗(yàn)。冷凍電鏡技術(shù)在藥品開發(fā)過程中的應(yīng)用實(shí)例,進(jìn)一步說明該技術(shù)在藥品(生物制品)的質(zhì)量方面有前瞻性的意義。在回顧技術(shù)應(yīng)用的同時,也看到了未來冷凍電鏡技術(shù)在新藥研發(fā)方面的幾個前瞻方向。我們相信冷凍電鏡在基于結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計、生物制劑高級結(jié)構(gòu)表征、冷鏈運(yùn)輸過程中的質(zhì)量控制中將發(fā)揮越來越重要的作用。冷凍電子顯微鏡技術(shù)還將普遍應(yīng)用于細(xì)胞組織的超微結(jié)構(gòu)解析,對解開生命活動的規(guī)律和機(jī)制等產(chǎn)生更大影響。
冷凍電子顯微鏡技術(shù)步驟之樣品制備:用于冷凍電鏡研究的生物樣品必須非常純凈。生物樣品是在高真空的條件下成像的,所以樣品的制備既要能夠保持本身的結(jié)構(gòu)又能抗脫水、電子輻射。現(xiàn)在普遍采用的方法是通過快速冷凍使含水樣品中的水處于玻璃態(tài),也就是在親水的支持膜上將含水樣品包埋在一層較樣品略高的薄冰內(nèi)。冰的結(jié)構(gòu)多種多樣,包括六角形冰、立方體冰等,其物理狀態(tài)與冷凍速率有關(guān)。若要形成玻璃態(tài)(即無定形態(tài))的冰,需要冷凍速率達(dá)到每秒鐘104攝氏度。此時,冰的結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)各向同性,不會因成像角度不同而導(dǎo)致圖像產(chǎn)生偏差。該方法有兩個步驟:一是將樣品在載網(wǎng)上形成一薄層水膜:二是將第步獲得的含水薄膜樣品快速冷凍。在多數(shù)情況下,用手工將載網(wǎng)迅速浸入液氮內(nèi)可使水冷凍成為玻璃態(tài)。其優(yōu)點(diǎn)在于將樣品保持在接近生活狀態(tài),不會因脫水而變形,同時可以減少輻射損傷。冷凍電鏡技術(shù)主要研究組織、細(xì)胞和微生物中的超微結(jié)構(gòu)。南京冷凍電鏡單顆粒技術(shù)服務(wù)電話
冷凍電鏡技術(shù)的研究,主要是冷凍成像和蛋白快速冷凍技術(shù)。南京冷凍電鏡單顆粒技術(shù)服務(wù)電話
單顆粒冷凍電鏡技術(shù)的圖像處理技術(shù):經(jīng)過多年的發(fā)展,目前冷凍電鏡的數(shù)據(jù)處理部分主要包含了以下的流程:(1)襯度傳遞函數(shù)的修正(CTFcorrection);(2)樣品分子投影數(shù)據(jù)的篩選(particleselection);(3)二維投影數(shù)據(jù)的分類和降噪(2Danalysis);(4)三維模型的重構(gòu)和優(yōu)化(3Dreconstructionandrefinement);(5)多重構(gòu)象的結(jié)構(gòu)分析(heterogeneityanalysis);(6)對重建結(jié)構(gòu)分辨率的分析(structureresolutionassessment);(7)結(jié)合生物化學(xué)原理和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)對三維結(jié)構(gòu)的解讀(modelinterpretationandvalidation)。南京冷凍電鏡單顆粒技術(shù)服務(wù)電話