冷凍電鏡技術測定結構的幾種方法：X射線晶體學、NMR、和冷凍電鏡技術各有優缺點，將這幾種方法結合共同研究結構與功能將使結構生物學家對所研究的分子有更為全部的理解，而這些信息是單用任何一個方法所無法獲得的。將X射線晶體模型與經電鏡獲得的密度圖重合可以對電鏡三維重構的結構作更詳盡的解釋，例如將牛的水通道（AQP1,與人的有90%同源性）的高分辨率的晶體結構與先前用冷凍電鏡技術重構出來的人的中等分辨率水通道的三維結構進行比較，可以進一步確定冷凍電鏡獲得的中等分辨率的結構，同時也顯示出了冷凍電鏡技術的優勢和局限性。另一方面，較低分辨率的電鏡三維重構模型可以用來解釋病毒或大分子的晶體結構。而且，將X射線晶體的精細結構與冷凍電鏡的重構模型結合構建生物大分子復合物在發揮功生物學功能過程中出現的構像變化模型。這很大程度增加了我們對于復雜分子的活動機制的理解。電子顯微技術，成像技術，計算機技術，生物信息技術等不同學科的結合，將為我們提供研究生命現象與本質的強有力的手段。冷凍電子顯微技術學解析生物大分子及細胞結構的中心是透射電子顯微鏡成像。南京低溫電子顯微鏡技術應用

低溫冷凍透射電鏡技術的特點：相對于常溫透射電鏡，低溫透射電鏡的優勢有：①快速冷凍制樣技術將樣品固定在玻璃態的冰層中，避免了水或溶劑結晶對樣品結構的破壞，能夠保持液相中有機分子自組裝體和化學反應中間體的微觀結構，避免了樣品干燥引起的結構變化;②高分子及化學反應體系常常具有非平衡態結構，快速冷凍制樣技術能夠保持住非平衡態結構，進而得以觀察;③低溫條件能夠盡可能保持有機和高分子等軟物質材料的微觀結構，明顯減少電子束對樣品的損傷。南京低溫電子顯微鏡技術應用冷凍電鏡技術，是在低溫下使用透射電子顯微鏡觀察樣品的顯微技術。

冷凍電鏡技術的應用情況：近年來，冷凍電鏡技術在全球范圍被大眾所熟知，并且被越來越多的學術界和跨國制藥企業所采用。在藥物研發方面，多個跨國公司已經將冷凍電鏡技術用于藥物發現。雖然冷凍電鏡技術屬于前沿技術，但目前已經有利用冷凍電鏡基于結構研發的藥物進入臨床試驗。冷凍電鏡技術在藥品開發過程中的應用實例，進一步說明該技術在藥品（生物制品）的質量方面有前瞻性的意義。在回顧技術應用的同時，也看到了未來冷凍電鏡技術在新藥研發方面的幾個前瞻方向。我們相信冷凍電鏡在基于結構的藥物設計、生物制劑高級結構表征、冷鏈運輸過程中的質量控制中將發揮越來越重要的作用。

冷凍電鏡技術解析結構的一般流程是怎樣的？對樣品的要求是什么？冷凍電鏡解析蛋白結構一般流程為：蛋白表達純化；負染樣品準備：約2小時完成；負染樣品的數據收集：約8小時完成；冷凍樣品的準備：約4小時完成；冷凍樣品的數據收集：48-120小時完成。三維結構重建。冷凍電鏡解析蛋白結構對蛋白質的要求：分子量：一般需要樣品的分子量在200kD以上。緩沖液：緩沖液中不能含有多糖，DMSO，甘油等有機物質，這些會降低樣品的襯度，難以獲得高分辨的三維結構。一般而言，緩沖液為20mMHepes，150mMNaCl。濃度：一般而言，可溶性蛋白濃度應在1mg/ml左右，膜蛋白應保證濃度在5mg/ml左右。體積：20ul足夠（前提是需要蛋白濃度達標，做一個樣品3ul左右）。均一性：分子篩行為表現為單一的峰，均一性大于90%。冷凍電鏡技術可以通過揭示細胞里發生的生命過程細節，幫助人們了解很多有意思的生物學現象。

單顆粒冷凍電鏡技術的圖像處理技術：經過多年的發展，目前冷凍電鏡的數據處理部分主要包含了以下的流程：(1)襯度傳遞函數的修正(CTFcorrection)；(2)樣品分子投影數據的篩選(particleselection)；(3)二維投影數據的分類和降噪(2Danalysis)；(4)三維模型的重構和優化(3Dreconstructionandrefinement)；(5)多重構象的結構分析(heterogeneityanalysis)；(6)對重建結構分辨率的分析(structureresolutionassessment)；(7)結合生物化學原理和實驗數據對三維結構的解讀(modelinterpretationandvalidation)。主要使用的幾種冷凍電子顯微學技術結構解析方法包括：電子晶體學、單顆粒重構技術、電子斷層掃描等。南京低溫電子顯微鏡技術應用

冷凍電鏡技術的獨特優勢：它與X射線晶體學、核磁共振一起構成了結構生物學研究的基礎。南京低溫電子顯微鏡技術應用

冷凍電鏡技術中的單顆粒分析法（Singleparticleanalysis,SPA）：單顆粒技術獲得投影的具體方法：制備很多具有同樣結構的大分子樣品，將其進行分散冷凍后進行隨機的投影拍照，再通過計算模擬測定角度，對具有相同角度的粒子進行組合，突出其中更特殊、更容易解釋的特征。單顆粒冷凍電鏡是針對單個粒子進行重構的技術，但我們的研究對象往往是多構象或結構異質的蛋白，顆粒之間存在細微差別，這是一些蛋白質無法獲得高分辨結構的重要原因之一。對于結構異質性樣品的分析，我們需要首先將樣品分成幾個同質的子集，然后分別進行三維重建。由于單顆粒分析法理論成像分辨率更高，尤其在分析具有同質性結構的樣品時表現出更方便、更優異的成像能力，因此得到了更普遍的應用。單顆粒分析法的研究對象可以是具有某種對稱性的顆粒，也可是不具有任何對稱性的蛋白分子或復合體，尤其是針對核糖體的表征。南京低溫電子顯微鏡技術應用