冷凍電鏡是什么？冷凍電鏡技術(shù)的應(yīng)用：冷凍電鏡主要用于掃描電鏡的很低溫冷凍制樣和傳輸技術(shù)，英文名Cryo-SEM，利用冷凍電鏡技術(shù)可實(shí)現(xiàn)直接觀察液體和半液體及對(duì)電子束敏感的樣品，如生物、高分子材料等。尤其是在戴口罩戴口罩中，利用冷凍電鏡技術(shù)可解析病毒結(jié)構(gòu)、推測(cè)其侵染人體細(xì)胞的路徑等傳播原理發(fā)揮了重要作用，為人類攻堅(jiān)戴口罩防護(hù)、研發(fā)疫苗提供了重要的理論依據(jù)。冷凍電鏡是什么？樣品經(jīng)過(guò)很低溫冷凍、斷裂、鍍膜制樣（噴金/噴碳）等處理后，通過(guò)冷凍傳輸系統(tǒng)放入電鏡內(nèi)的冷臺(tái)（溫度可至-185℃）即可進(jìn)行觀察。其中，快速冷凍技術(shù)可使水在低溫狀態(tài)下呈玻璃態(tài)，減少冰晶的產(chǎn)生，從而不影響樣品本身結(jié)構(gòu)，冷凍傳輸系統(tǒng)保證在低溫狀態(tài)下對(duì)樣品進(jìn)行電鏡觀察。冷凍電子顯微鏡技術(shù)步驟樣品制備注意：用于冷凍電鏡研究的生物樣品必須非常純凈。冷凍電鏡技術(shù)應(yīng)用

單顆粒冷凍電鏡技術(shù)樣品的篩選和數(shù)據(jù)采集：在開(kāi)始高分辨數(shù)據(jù)采集前，可以利用冷凍電鏡先對(duì)樣品質(zhì)量進(jìn)行評(píng)估，包括但不限于蛋白濃度、穩(wěn)定性和分布，冰層厚度、質(zhì)量和載網(wǎng)各處的均一性等的檢查。用戶可以在120kV電鏡或200kV電鏡上進(jìn)行此篩樣過(guò)程。待到樣品通過(guò)篩選，用戶可以利用300kV或200kV電鏡采集更大的數(shù)據(jù)量來(lái)幫助開(kāi)展2D和3D分析。200kV-TalosArctica透射電鏡配備了直接電子探測(cè)相機(jī)FalconIII,在樣品質(zhì)量較高時(shí)，較高可以獲得<3?的數(shù)據(jù)。目前的300kV-TitianKrios透射電鏡有兩套，其中一臺(tái)配備了目前行業(yè)前列的K3直接電子探測(cè)相機(jī)，另一臺(tái)配備有K2相機(jī)和能量過(guò)濾器，兩套電鏡均能夠進(jìn)行全自動(dòng)、長(zhǎng)時(shí)間無(wú)人照看的數(shù)據(jù)收集操作，可實(shí)現(xiàn)樣品的大規(guī)模數(shù)據(jù)采集，并獲得極高分辨率的結(jié)構(gòu)信息。收集得到數(shù)以萬(wàn)計(jì)的單顆粒物照片后，用戶可以使用平臺(tái)集群已安裝的常用三維重構(gòu)計(jì)算軟件以及相關(guān)生物軟件對(duì)數(shù)據(jù)集進(jìn)行計(jì)算處理。冷凍電鏡技術(shù)應(yīng)用冷凍電鏡技術(shù)助力快速、高效的新藥研發(fā)。

冷凍電鏡技術(shù)中的電子斷層掃描技術(shù)與單顆粒分析法的比較：?jiǎn)晤w粒分析法：它的優(yōu)點(diǎn)：解析生物大分子的理論分辨率可達(dá)原子級(jí)；樣品受總輻射值小；對(duì)稱顆粒的解析分辨率更高；分子量越大，結(jié)果越好；電子斷層掃描技術(shù)：優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)單直接；對(duì)樣品的要求較低；常用于對(duì)細(xì)胞或者生物組織結(jié)構(gòu)的三維重構(gòu)；但是，對(duì)同一樣品位置多次拍照時(shí)，電子束對(duì)樣品的輻照損傷就會(huì)成為了比較嚴(yán)重的問(wèn)題；當(dāng)樣品旋轉(zhuǎn)角度受到電子束透過(guò)樣品厚度能力的限制。

冷凍電鏡技術(shù)原理之電子晶體學(xué)：利用電子顯微鏡對(duì)生物大分子在一維、二維以致三維空間形成的高度有序重復(fù)排列的結(jié)構(gòu)(晶體)成像或者收集衍射圖樣，進(jìn)而解析這些生物大分子的結(jié)構(gòu)，這種方法稱為電子晶體學(xué)。其適合的樣品分子量范圍為10~500kD，Zgao分辨率約0.19nm。該方法與X射線晶體學(xué)的類似之處在于均需獲得高度均一的生物大分子的周期性排列，不同之處是利用電子顯微鏡除了可以獲得晶體的電子衍射外還可以通過(guò)獲得晶體的圖像來(lái)進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析。冷凍電鏡技術(shù)之冷凍透射電鏡優(yōu)點(diǎn)：樣品臺(tái)穩(wěn)定;第四是全自動(dòng)，自動(dòng)換液氮，自動(dòng)換樣品，自動(dòng)維持清潔。

單顆粒冷凍電鏡技術(shù)的圖像處理技術(shù)：經(jīng)過(guò)多年的發(fā)展，目前冷凍電鏡的數(shù)據(jù)處理部分主要包含了以下的流程：(1)襯度傳遞函數(shù)的修正(CTFcorrection)；(2)樣品分子投影數(shù)據(jù)的篩選(particleselection)；(3)二維投影數(shù)據(jù)的分類和降噪(2Danalysis)；(4)三維模型的重構(gòu)和優(yōu)化(3Dreconstructionandrefinement)；(5)多重構(gòu)象的結(jié)構(gòu)分析(heterogeneityanalysis)；(6)對(duì)重建結(jié)構(gòu)分辨率的分析(structureresolutionassessment)；(7)結(jié)合生物化學(xué)原理和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)對(duì)三維結(jié)構(gòu)的解讀(modelinterpretationandvalidation)。冷凍電鏡技術(shù)用于生物樣品三維結(jié)構(gòu)解析，包含單顆粒分析、微晶電子衍射和冷凍電子斷層掃描3種技術(shù)。冷凍電鏡技術(shù)應(yīng)用

單顆粒冷凍電鏡技術(shù)首先捕獲大量隨機(jī)分布的同一種生物樣品的二維圖像，通過(guò)圖像處理算法解析其三維結(jié)構(gòu)。冷凍電鏡技術(shù)應(yīng)用

冷凍電子顯微鏡技術(shù)之樣品成像：低劑量輻照成像，普通的樣品材料在進(jìn)行TEM表征時(shí)，電子劑量越高，成像質(zhì)量越好。但生物樣品受到的輻照損傷卻是和累積的輻照總劑量相關(guān)的。更詳細(xì)一點(diǎn)說(shuō)，隨著輻照劑量的增加，輻照損傷對(duì)高分辨細(xì)節(jié)的破壞更嚴(yán)重。因此，為了盡可能地獲得更多的細(xì)節(jié)，就必須要對(duì)樣品采用用低劑量輻照成像。在冷凍電鏡技術(shù)中，常用的低劑量輻照成像法有兩種：冷凍電子斷層掃描法，單顆粒分析成像法。冷凍電鏡技術(shù)中的電子斷層掃描技術(shù)（cryogeniccomputedtomography）：進(jìn)行斷層掃描時(shí)，樣品被連續(xù)不停地旋轉(zhuǎn)，并在每個(gè)旋轉(zhuǎn)角度上都進(jìn)行一次成像。每一幅電子顯微像是物體在不同投影方向的二維投影像,經(jīng)傅立葉變換會(huì)得到一系列不同取向的截面，當(dāng)截面足夠多時(shí)，會(huì)得到傅立葉空間的三維信息，再經(jīng)傅立葉反變換便能得到物體的三維結(jié)構(gòu)。冷凍電鏡技術(shù)應(yīng)用

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