冷凍電子顯微鏡技術之樣品成像：低劑量輻照成像，普通的樣品材料在進行TEM表征時，電子劑量越高，成像質量越好。但生物樣品受到的輻照損傷卻是和累積的輻照總劑量相關的。更詳細一點說，隨著輻照劑量的增加，輻照損傷對高分辨細節的破壞更嚴重。因此，為了盡可能地獲得更多的細節，就必須要對樣品采用用低劑量輻照成像。在冷凍電鏡技術中，常用的低劑量輻照成像法有兩種：冷凍電子斷層掃描法，單顆粒分析成像法。冷凍電鏡技術中的電子斷層掃描技術（cryogeniccomputedtomography）：進行斷層掃描時，樣品被連續不停地旋轉，并在每個旋轉角度上都進行一次成像。每一幅電子顯微像是物體在不同投影方向的二維投影像,經傅立葉變換會得到一系列不同取向的截面，當截面足夠多時，會得到傅立葉空間的三維信息，再經傅立葉反變換便能得到物體的三維結構。冷凍電鏡技術之冷凍蝕刻電子顯微鏡優點：樣品通過冷凍，可使其微細結構接近于活的狀態。武漢透射電鏡技術服務中心

冷凍電鏡技術的儀器結構：冷凍電子顯微鏡的儀器結構與透射電子顯微鏡的基本結構相似，只是在進樣之前搭載了液態乙烷罐與冷凍倉，保證在樣品快速冷凍后能夠即刻轉移至樣品倉內。冷凍室：在實際操作中，向液態乙烷中投入樣品時，乙烷會在樣品周圍快速沸騰，形成絕緣氣態膜，減慢向低溫液體的熱傳遞，稱為萊頓弗羅斯效果好應。因此要使厚度超過幾微米的樣品中的水以足夠高的冷卻速度產生非晶冰非常困難。冷凍室中加入旋轉葉片真空泵將冷凍劑泵入，可以提高冷卻速度。武漢透射電鏡技術服務中心冷凍電鏡技術采用的快速冷凍技術關鍵在于“快速”。

冷凍電鏡技術基本原理之三維冷凍電鏡技術：樣品經過在液氮中的冷凍固定，使得生物大分子中的H2O分子以玻璃態的形式存在，保持低溫，將樣品放入顯微鏡，高度相干的電子作為光源從上面照射下來，透過樣品和附近的冰層，受到散射，利用探測器和透鏡系統把散射的信號成像記錄下來，再進行信號處理，較后利用三維重構的技術得到樣品的三維結構。冷凍電鏡技術的獨特優勢分辨率高：光學顯微鏡的分辨率為0.2μm，透射電子顯微鏡的分辨率為0.2nm，透射電子顯微鏡在光學顯微鏡的基礎上放大了1000倍。

冷凍電鏡技術具有分辨率高、更接近天然狀態、適用研究對象普遍等特點，越來越多的科學家開始把冷凍電鏡技術作為研究的一個新方向。冷凍電鏡技術與X射線技術和核磁共振技術互相補充，讓絕大多數的蛋白質的結構都可以被解析。眾多領域的研究者們將在未來冷凍電鏡新的技術方法的開發中發揮重要的作用，成為該技術的進一步完善與成熟的重要力量。冷凍電鏡領域研究者們則需要以主動開放的態度吸引其他領域研究者的合作，并積極迎接來自更多領域研究者的挑戰，保持并發展自己的技術特長，站在技術發展的制高點上選準研究方向，始終在冷凍電鏡的技術前沿上開疆拓土。冷凍電子顯微鏡技術還將普遍應用于細胞組織的超微結構解析，對解開生命活動的規律和機制等產生更大影響。

冷凍電鏡技術揭示生物分子細節：冷凍電鏡可以通過揭示細胞里發生的生命過程細節，幫助人們了解很多有意思的生物學現象。比如，我們吃辣椒會覺得辣，是因為辣椒里有一種叫做辣椒素的小分子。辣椒素與位于舌頭神經末梢的膜蛋白TPRV1結合，打開膜蛋白上的一個通道，讓細胞膜外面的離子向細胞膜內部流動，這樣微小的流動產生的電流通過神經纖維較終傳遞到我們的大腦，讓我們感受到辣的感覺。2013年，科學家利用冷凍電鏡技術，以近原子分辨率解析了膜蛋白TRPV1的通道結構，以及它與辣椒素相互結合的結構。人們由此了解到，實際上是由于辣椒素結合到4個亞基所組成的通道膜蛋白上把孔道撐開，才使得離子可以穿透。冷凍電鏡技術既完美契合了結構生物學的基礎研究，又能夠助力加速基于結構的藥物研發。武漢透射電鏡技術服務中心

冷凍電鏡技術中的單顆粒分析法的研究對象可以是具有某種對稱性的顆粒，也可不具有任何對稱性的蛋白分子。武漢透射電鏡技術服務中心

冷凍電鏡技術工作流程：首先是樣品制備。高純度、高濃度的蛋白樣品溶液被滴在一個特制的樣品載網上面。載網由一張布滿小孔的超薄非晶碳薄膜和金屬支撐框架組成，在表面張力的作用下，微孔上會形成一層跨孔的薄水膜。將多余溶液吸走后，把載有蛋白溶液超薄膜的載網迅速投入到液態乙烷冷凍劑中使其快速冷凍，從而使蛋白質分散固定在玻璃態的冰膜中。然后電鏡圖像采集。選擇較有可能產生較佳圖像的較佳顆粒密度和玻璃態冰厚度的樣品。武漢透射電鏡技術服務中心

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