冷凍電鏡技術(shù)解析結(jié)構(gòu)主要風險在:A.樣品很不穩(wěn)定,樣品寄送過來的時候,已經(jīng)降解或者聚集,無法進行后續(xù)處理;B.樣品在冷凍制樣的過程中,可能會被凍碎,從而無法進行后續(xù)處理;C.樣品純度可能很好,但是均一度很差,從而難以獲得樣品的高分辨結(jié)構(gòu);D.我們關(guān)心的區(qū)域可能在整個復(fù)合體中有很強的柔性,從而經(jīng)過二維或者三維平均后,我們關(guān)心區(qū)域的分辨率會比較差甚至看不見,達不到我們的預(yù)期;E.一些配體,比如藥物前體分子,分子量太小,不一定能在電鏡的密度圖中觀測到;F.對于合適的樣品,我們冷凍制樣需要優(yōu)化的參數(shù)有很多,包括樣品濃度的優(yōu)化,blottime的優(yōu)化,溫度的優(yōu)化,grid規(guī)格(銅網(wǎng)或者金網(wǎng))的優(yōu)化等一系列條件的優(yōu)化。因此冷凍電鏡制樣需要豐富的經(jīng)驗和充足的機時支持,不同的實驗者,成功率可能差別很大。冷凍電鏡技術(shù)測定結(jié)構(gòu)的幾種方法:X射線晶體學、NMR、和冷凍電鏡技術(shù)。無錫TEM技術(shù)平臺
單顆粒冷凍電鏡技術(shù)的圖像處理技術(shù):經(jīng)過多年的發(fā)展,目前冷凍電鏡的數(shù)據(jù)處理部分主要包含了以下的流程:(1)襯度傳遞函數(shù)的修正(CTFcorrection);(2)樣品分子投影數(shù)據(jù)的篩選(particleselection);(3)二維投影數(shù)據(jù)的分類和降噪(2Danalysis);(4)三維模型的重構(gòu)和優(yōu)化(3Dreconstructionandrefinement);(5)多重構(gòu)象的結(jié)構(gòu)分析(heterogeneityanalysis);(6)對重建結(jié)構(gòu)分辨率的分析(structureresolutionassessment);(7)結(jié)合生物化學原理和實驗數(shù)據(jù)對三維結(jié)構(gòu)的解讀(modelinterpretationandvalidation)。無錫TEM技術(shù)平臺冷凍電子顯微鏡技術(shù)之樣品成像:低劑量輻照成像,普通樣品材料在進行表征時,電子劑量越高成像質(zhì)量越好。
什么是冷凍電鏡技術(shù)?冷凍電鏡技術(shù),全稱是冷凍電子顯微鏡技術(shù),是在低溫下使用透射電子顯微鏡觀察樣品的顯微技術(shù)。冷凍電鏡技術(shù),是一種重要的結(jié)構(gòu)生物學研究方法,它與X射線晶體學、核磁共振一起構(gòu)成了高分辨率結(jié)構(gòu)生物學研究的基礎(chǔ)。冷凍電鏡技術(shù)的研究,主要是冷凍成像和蛋白快速冷凍技術(shù)。根據(jù)諾貝爾獎評委會的說法,冷凍電鏡技術(shù)使生物分子成像,變得更加簡單,把生物化學帶入了一個新紀元。這項技術(shù)可以用來確定,溶液中生物分子的高清晰度結(jié)構(gòu)。冷凍電鏡技術(shù)其實比較抽象,一直以來它主要的問題是其圖像噪音極高、信號極低,研究的目標是從中提取近原子分辨率的結(jié)構(gòu)信息??梢孕蜗蟮谋扔鳛樵谝粋€機器轟鳴的工廠,監(jiān)測一只螞蟻爬行的聲音。冷凍電鏡的目標,就是要完成這項艱巨的任務(wù)。因此,可見這項技術(shù)成果的科學價值。
冷凍電鏡技術(shù),是用于掃描電鏡的很低溫冷凍制樣及傳輸技術(shù)(Cryo-SEM),可實現(xiàn)直接觀察液體、半液體及對電子束敏感的樣品,如生物、高分子材料等。電鏡觀察:樣品經(jīng)過很低溫冷凍、斷裂、鍍膜制樣(噴金/噴碳)等處理后,通過冷凍傳輸系統(tǒng)放入電鏡內(nèi)的冷臺(溫度可至-185℃)即可進行觀察。其中,快速冷凍技術(shù)可使水在低溫狀態(tài)下呈玻璃態(tài),減少冰晶的產(chǎn)生,從而不影響樣品本身結(jié)構(gòu),冷凍傳輸系統(tǒng)保證在低溫狀態(tài)下對樣品進行電鏡觀察。冷凍電鏡技術(shù)中單顆粒分析法優(yōu)點:樣品受總輻射值小;對稱顆粒的解析分辨率更高。
冷凍電子顯微技術(shù)學解析生物大分子及細胞結(jié)構(gòu)的中心是透射電子顯微鏡成像,包括樣品制備、圖像采集、圖像處理及三維重構(gòu)等幾個基本步驟。三維重構(gòu):數(shù)據(jù)處理的較終目的是為了獲得生物樣品的三維質(zhì)量密度圖,由二維圖像推知三維結(jié)構(gòu)的方法即三維重構(gòu)。其理論原理是在1968年由DeRosier和Klug提出的中心截面定理:一個函數(shù)沿某方向投影函數(shù)的傅里葉變換等于此函數(shù)的傅里葉變換通過原點且垂直于此投影方向的截面函數(shù)。由于樣品性質(zhì)的不同,圖像分析的方法也有差異。冷凍電鏡技術(shù)的獨特優(yōu)勢:它與X射線晶體學、核磁共振一起構(gòu)成了結(jié)構(gòu)生物學研究的基礎(chǔ)。無錫TEM技術(shù)平臺
冷凍電鏡技術(shù)中的單顆粒分析法理論成像分辨率更高。無錫TEM技術(shù)平臺
冷凍電子顯微鏡技術(shù)之樣品成像:低劑量輻照成像,普通的樣品材料在進行TEM表征時,電子劑量越高,成像質(zhì)量越好。但生物樣品受到的輻照損傷卻是和累積的輻照總劑量相關(guān)的。更詳細一點說,隨著輻照劑量的增加,輻照損傷對高分辨細節(jié)的破壞更嚴重。因此,為了盡可能地獲得更多的細節(jié),就必須要對樣品采用用低劑量輻照成像。在冷凍電鏡技術(shù)中,常用的低劑量輻照成像法有兩種:冷凍電子斷層掃描法,單顆粒分析成像法。冷凍電鏡技術(shù)中的電子斷層掃描技術(shù)(cryogeniccomputedtomography):進行斷層掃描時,樣品被連續(xù)不停地旋轉(zhuǎn),并在每個旋轉(zhuǎn)角度上都進行一次成像。每一幅電子顯微像是物體在不同投影方向的二維投影像,經(jīng)傅立葉變換會得到一系列不同取向的截面,當截面足夠多時,會得到傅立葉空間的三維信息,再經(jīng)傅立葉反變換便能得到物體的三維結(jié)構(gòu)。無錫TEM技術(shù)平臺
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