單顆粒冷凍電鏡技術的顆粒挑選：接下來需要從原始數據中篩選出顆粒投影，也被稱為“顆粒挑選”，顆粒挑選的好壞也將影響所有后續的分析和處理過程，是一個重要并且繁瑣的步驟。顆粒挑選方式可以分為手動挑選、半自動挑選和完全自動挑選這幾種。在早期的分析中，對于結構的了解還非常少，優先考慮的都是人工挑選。但是自動的顆粒圖像獲取方法的出現使得在很短時間內可以收集數十萬張顆粒圖像，人工挑選大量的顆粒圖像不太現實，并且人工的挑選通常會過于集中于某一類顆粒圖像，導致遺漏和偏差。半自動和全自動的方法主要有以下三類：(1)通過例如降噪、反襯增強、邊緣算子等圖像形態學方法搜索區域，基于數字圖像處理學的原理，將顆粒圖像與背景分離開來。(2)基于模板的方法，通過掃描數據圖像和已知的模板比較來挑選出潛在的顆粒圖像，模板的來源通常為手動選出的數據圖像中較為清晰的顆粒圖像，或者是已知結構的投影。(3)結合無模板和有模板的方法，通過一些有監督的機器學習算法進行顆粒挑選。冷凍電鏡技術之冷凍透射電鏡是將樣品冷卻到液氮溫度，用于觀測蛋白、生物切片等對溫度敏感的樣品。黃山生物冷凍透射電子顯微鏡技術服務中心

冷凍電鏡技術解析結構主要風險在：A.樣品很不穩定，樣品寄送過來的時候，已經降解或者聚集，無法進行后續處理；B.樣品在冷凍制樣的過程中，可能會被凍碎，從而無法進行后續處理；C.樣品純度可能很好，但是均一度很差，從而難以獲得樣品的高分辨結構；D.我們關心的區域可能在整個復合體中有很強的柔性，從而經過二維或者三維平均后，我們關心區域的分辨率會比較差甚至看不見，達不到我們的預期；E.一些配體，比如藥物前體分子，分子量太小，不一定能在電鏡的密度圖中觀測到；F.對于合適的樣品，我們冷凍制樣需要優化的參數有很多，包括樣品濃度的優化，blottime的優化，溫度的優化，grid規格（銅網或者金網）的優化等一系列條件的優化。因此冷凍電鏡制樣需要豐富的經驗和充足的機時支持，不同的實驗者，成功率可能差別很大。黃山生物冷凍透射電子顯微鏡技術服務中心冷凍電鏡技術用于生物樣品三維結構解析，包含單顆粒分析、微晶電子衍射和冷凍電子斷層掃描3種技術。

冷凍電鏡技術的應用場景：冷凍電鏡主要應用在結構生物學和材料科學當中，如在2020戴口罩戴口罩中研究人員通過冷凍電鏡技術在解析病毒結構、推測其侵染人體細胞的路徑等傳播原理發揮了重要作用，研究人員將戴口罩的結構與其他幾種冠狀病毒進行了比較，發現2019-nCoV的S蛋白整體結構與SARS病毒S蛋白的整體結構相似，各個結構之間具有高度同源性。在材料科學的應用中，冷凍電鏡技術在一些對電子束、熱敏感材料，如鈣鈦礦材料、某些高分子材料、水凝膠、量子點等精細結構的物理表征與機理研究中也具有巨大的應用潛力。

冷凍電鏡技術之冷凍透射電鏡：冷凍透射電鏡(Cryo-TEM)通常是在普通透射電鏡上加裝樣品冷凍設備，將樣品冷卻到液氮溫度(77K)，用于觀測蛋白、生物切片等對溫度敏感的樣品。通過對樣品的冷凍，可以降低電子束對樣品的損傷，減小樣品的形變，從而得到更加真實的樣品形貌。它的優點主要體現在以下幾個方面：首先是加速電壓高，電子能穿透厚樣品;第二是透鏡多，光學性能好;第三是樣品臺穩定;第四是全自動，自動換液氮，自動換樣品，自動維持清潔。冷凍電鏡技術中的單顆粒分析法的研究對象可以是具有某種對稱性的顆粒，也可不具有任何對稱性的蛋白分子。

冷凍電子顯微技術的發展與完善經歷了復雜而艱辛的探索，下面，我們將深入解析冷凍電子顯微鏡的工作原理、流程與儀器結構，揭開它的廬山真面目。樣品制備：樣品快速冷凍技術：樣品的原位冷凍固定處理是低溫電子顯微鏡標本制備的開始。冷凍電鏡采用的快速冷凍技術關鍵在于“快速”。這是由于：采用常規冷凍手段，水分子會在氫鍵作用下形成冰晶，一來會改變樣品結構，二來在成像過程中，冰晶體會產生強烈的電子衍射掩蓋樣品信號。而當冷凍速率足夠快時，水分子在形成晶體之前就會凝固成無定形的玻璃態冰，具有非晶態特性，保證了在電子束探測成像的過程中不會對樣品成像造成干擾。冷凍固定時，樣品首先放置在由液氮冷卻的容器中，隨后被快速浸入液態乙烷中。采用液態乙烷作為冷凍劑的目的是為了使冷凍速率足夠快，在冷凍過程中，樣品將以每秒104至106K的速度被快速冷卻。生物樣品中的水被玻璃化冷凍后，樣品結構就得到了保持和固定，同時玻璃化冰也不會在真空環境中揮發，在一定程度上保護了樣品免受電子輻射的損傷。冷凍電鏡技術助力快速、高效的新藥研發。黃山生物冷凍透射電子顯微鏡技術服務中心

冷凍電鏡技術之冷凍透射電鏡優點：樣品臺穩定;第四是全自動，自動換液氮，自動換樣品，自動維持清潔。黃山生物冷凍透射電子顯微鏡技術服務中心

冷凍電鏡技術的儀器結構：（1）圖像記錄系統：收集來自樣品的電子信號，在熒光屏上形成圖像。（2）電子槍：產生電子束的部分，聚光鏡系統負責將電子束聚焦到樣本樣品上。（3）圖像生成系統：由物鏡，中間和投影儀鏡頭以及可移動平臺組成。冷凍電鏡已經能解析出生物大分子的原子級分辨率（0.2-0.3nm）結構，但是這一結果離物理極限還有較大距離。長久以來，冷凍電鏡在結構生物學領域取得了巨大成功，目前，多構象蛋白的三維分類問題和生物大分子的動力學分析依然是充滿挑戰的研究方向，新型的算法發展也將主要圍繞這些問題展開。而作為一種低信號源激發測試技術，冷凍電鏡技術在一些對電子束、熱敏感材料，如鈣鈦礦材料、某些高分子材料、水凝膠、量子點等精細結構的物理表征與機理研究中也具有巨大的應用潛力。他山之石，可以攻玉。隨著硬件設備與模擬算法的改進，這項帶著結構生物化學研究邁入新紀元的技術，未來必定擁有更加廣闊的應用前景。黃山生物冷凍透射電子顯微鏡技術服務中心

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