大多數(shù)zhiliao抗體攜帶人 IgG1 骨架，雙特異性或多特異性形式的開(kāi)發(fā)正在迅速增加。此類(lèi)抗體的分析需要特異性酶來(lái)表征特性，例如單價(jià)結(jié)合、二硫鍵擾亂和配對(duì) Fc 糖基化。傳統(tǒng)方案包括使用木瓜蛋白酶和 Lys-C 的酶消化，這需要優(yōu)化以大限度地減少過(guò)度消化并獲得足夠的產(chǎn)量。Genovis的半胱氨酸蛋白酶 FabALACTICA （IgdE） 在鉸鏈上方的一個(gè)特定位點(diǎn)消化人 IgG1，以產(chǎn)生完整的 Fab 和 Fc 片段。該酶在大多數(shù)人IgG1 上也具有活性，其中鉸鏈區(qū)域以下的突變已被引入。為了證明FabALACTICA的性能，我們消化了不同的人IgG1抗體，并使用RP-HPLC分析了所得片段。用FabALACTICA消化后觀察到的定義峰顯示了不同人IgG1抗體的均質(zhì)片段生成和強(qiáng)大的酶性能。FabALACTICA 酶也可用于生成完整的 Fc 片段。消化在1小時(shí)內(nèi)完成，且具有特異性。即使孵育時(shí)間延長(zhǎng)，也沒(méi)有過(guò)度消化的風(fēng)險(xiǎn)。江蘇FabRICATORIdeS蛋白酶

LC-MS中級(jí)分析是一種被大眾接受的分析方法，用于快速表征mAb和其他基于IgG的生物制藥。它有助于理解多種關(guān)鍵質(zhì)量屬性 （CQA），例如糖基化、氧化和 C 端賴(lài)氨酸剪切。這種關(guān)于翻譯后修飾（PTM）的詳細(xì)知識(shí)是生物制藥開(kāi)發(fā)和制造所必需的。Genovis的FabRICATOR HPLC酶色譜柱，可快速進(jìn)行單克隆抗體的柱上酶切，并產(chǎn)生一致的亞基。該色譜柱含有固定化的FabRICATOR（IdeS）酶，可在鉸鏈下方快速且特異性地消化IgG，產(chǎn)生F（ab'）2和Fc片段，而不會(huì)出現(xiàn)任何過(guò)度消化的風(fēng)險(xiǎn)。為了減少樣品處理并為樣品制備提供自動(dòng)化解決方案，F(xiàn)abRICATOR被共價(jià)固定在樹(shù)脂上，并裝在適用于HPLC的PEEK色譜柱硬件中。使用FabRICATOR HPLC色譜柱，只需稍作修改，即可使用標(biāo)準(zhǔn)HPLC-MS裝置自動(dòng)生成抗體亞基。然后，F(xiàn)abRICATOR HPLC色譜柱上消解產(chǎn)生的亞基被捕獲在在線連接的反相（RP）色譜柱的柱頭上。上海IdeS蛋白酶蛋白組學(xué)含有富含甘氨酸的連接子的各種mAb片段進(jìn)行詳細(xì)表征的中級(jí)方法。

其他基于 IgG 的生物制藥需要仔細(xì)表征和監(jiān)測(cè)關(guān)鍵質(zhì)量屬性，例如氧化、糖基化和其他翻譯后修飾。與抗體的克隆選擇、工藝開(kāi)發(fā)和穩(wěn)定性研究相關(guān)的大量樣品通常通過(guò)液相色譜質(zhì)譜 （LC-MS） 進(jìn)行分析。然而，在LC-MS之前進(jìn)行足夠規(guī)模的樣品制備通常具有挑戰(zhàn)性。為了解決樣品制備的挑戰(zhàn)，Genovis將半胱氨酸蛋白酶FabRICATOR（IdeS）固定在磁性瓊脂糖珠上，現(xiàn)在稱(chēng)為FabRICATOR MagIC。FabRICATOR固定在磁珠上，可同時(shí)快速自動(dòng)消化多種抗體，促進(jìn)中級(jí)表征工作流程。Genovis的FabRICATOR MagIC 如何以較少的用戶(hù)交互減少實(shí)驗(yàn)和操作時(shí)間，降低樣品處理錯(cuò)誤的風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)提高通量。

Genovis的半胱氨酸蛋白酶 FabALACTICA （IgdE）與IdeS酶一樣是特異性蛋白酶。在二維核磁共振波譜 （2D-NMR） 之后，可以通過(guò) HOS 分析在精確的原子水平上評(píng)估 mAb 的關(guān)鍵質(zhì)量屬性。從Genovis的FabALACTICA Immobilized獲得均相Fab和Fc片段的工作流程，是評(píng)估嵌合單克隆抗體英夫利昔單抗中HOS的理想選擇，在海報(bào)“FabALACTICA產(chǎn)生純和均相的mAb亞基，促進(jìn)2D-NMR波譜分析”中進(jìn)行了描述。來(lái)自生成的 Fab 和 Fc 片段的高質(zhì)量信號(hào)和光譜分辨率導(dǎo)致能夠觀察 Fab 和 Fc 之間的結(jié)構(gòu)變化、氧化和非氧化樣品之間的差異，并通過(guò)觀察原子分辨率來(lái)比較原研劑和生物仿制藥的 HOS。使用FabRICATOR（IdeS）的抗體消化的簡(jiǎn)單性、速度和可重復(fù)性也意味著這種酶可以被用于質(zhì)量控制應(yīng)用。

與肽圖譜相比，根據(jù)Genovis科學(xué)家的經(jīng)驗(yàn)，尤其是對(duì)于像抗體這樣的分子，許多人在常規(guī)實(shí)驗(yàn)中做了太多的肽圖譜，而中級(jí)水平（Middle-level）的方法可以很好地工作。中級(jí)方法（IdeS酶切抗體）需要更少的實(shí)際操作步驟和較少的示例處理，所有這些都意味著過(guò)程中出錯(cuò)的事情更少。我們的許多酶可以作為平臺(tái)方法，同樣的方法適用于絕大多數(shù)的抗體，這不是肽圖的情況下，可能需要優(yōu)化整個(gè)樣品制備，LC分離，質(zhì)譜設(shè)置和數(shù)據(jù)分析的每個(gè)不同的抗體分析。這些變化可能是很小的，但沒(méi)有一種適用于所有肽圖的方法。由于分析和數(shù)據(jù)分析的簡(jiǎn)單性，中級(jí)方法非常適合自動(dòng)化和高通量的工作流程。肽圖當(dāng)然可以自動(dòng)用于樣品制備，但高通量肽圖生成大量數(shù)據(jù)，仍然需要徹底分析。事實(shí)上，肽圖譜是一個(gè)多步驟的過(guò)程，每一個(gè)步驟都可能破壞方法，并可能導(dǎo)致破壞蛋白質(zhì)的人工制品，很難交叉訓(xùn)練給非專(zhuān)業(yè)人員。中級(jí)水平的方法很容易交叉訓(xùn)練，我們的方法在質(zhì)量控制實(shí)驗(yàn)室中被成功地使用。肽圖譜是一種用于修飾分析和氨基酸確認(rèn)的方法，但一旦完成了這一工作，我相信使用中級(jí)分析可以成功地更有效地完成抗體樣本的大部分工作。但要在親和步驟中捕獲 Fc 片段，您需要另一種填料。上海IdeS蛋白酶蛋白組學(xué)

孵育時(shí)間為過(guò)夜（16-18小時(shí)），并且由于酶的特異性，沒(méi)有過(guò)度消化的風(fēng)險(xiǎn)。江蘇FabRICATORIdeS蛋白酶

樣品制備的條件可能會(huì)在樣品中誘發(fā)偽影，因此需要避免高溫和堿性pH值進(jìn)行質(zhì)譜分析。如果可能的話，避免多個(gè)步驟并在一鍋反應(yīng)中進(jìn)行消化和還原也可能是有益的。與IdeS不同，為了探索Genovis的GingisREX對(duì)離液劑和去液劑的穩(wěn)定性和耐受性，在一系列試劑中測(cè)試了酶活性，并使用底物測(cè)定進(jìn)行了評(píng)估。數(shù)據(jù)顯示，GingisREX在6M時(shí)耐受尿素，吐溫高達(dá)1%，但活性在0.1%時(shí)受到SDC的負(fù)面影響。該酶在 pH 值范圍為 5.0 至 9.0 時(shí)顯示出活性，在 pH 值為 6.5-8.0 之間。綜上所述，GingisREX可用于一鍋反應(yīng)，以同時(shí)消化和變性6M尿素。與Genovis的IdeS不同，雙特異性 T 細(xì)胞接合器 （BiTE） 分子是一種融合蛋白療法，其中兩個(gè) scFv 融合，形成一個(gè)雙特異性分子，其中一個(gè) scFv 靶向細(xì)胞毒性 T 細(xì)胞，另一個(gè)靶向Ai癥抗原。該蛋白質(zhì)由四個(gè)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域組成，兩個(gè) scFv 均由 VL 和 VH 區(qū)域組成，總共由三個(gè)柔性 GS 連接子連接。這種蛋白質(zhì)的大尺寸（54 kDa）可能對(duì)通過(guò)完整質(zhì)譜法進(jìn)行產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)測(cè)構(gòu)成挑戰(zhàn)，因?yàn)闃?biāo)準(zhǔn)MS儀器可能無(wú)法提供蛋白質(zhì)的單同位素分辨率。江蘇FabRICATORIdeS蛋白酶