免疫組化結果背景染色較深的原因有哪些？

 （1）抗體濃度過高：一抗濃度過高是常見的原因之一。解決辦法是，每次使用新抗體前應當對其工作濃度進行測試，使每一抗體個體化，找到適合自己實驗室的理想工作濃度，既使是即用型的抗體也應如此，不能只簡單的按說明書進行染色。

（2）抗體孵育時間過長或溫度較高：解決辦法是，嚴格執行操作規程，比較好隨身佩帶報時表或報時鐘，及時提醒，避免因遺忘而造成時間延長?，F在流行的二步法（Polymer）敏感性很高，要求一抗孵育的時間不是傳統的1小時，而是30分鐘，因此，要根據染色結果進行調整。 

（3）DAB變質和顯色時間太長：DAB比較好現用現配，如有沉渣應進行過濾后再用。配制好的DAB不應存放時間太長，因為在沒有酶的情況下，過氧化氫也會游離出氧原子與DAB產生反應而降低DAB的效力，未用完的DAB存放在冰箱里幾天后再用這種似乎節約的辦法是不可取的。DAB的顯色比較好在顯微鏡下監控，達到理想的染色程度時立即終止反應。但是當染**太多時或用染色機時，這樣做似乎不現實，但至少應對一些新的或少用的抗體顯色時進行監控，避免顯色時間過長。

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免疫組化實驗流程介紹：

英瀚斯生物為您整理總結免疫組化詳細步驟：

1、SP三步法

1）石蠟切片，常規脫蠟至水。

2）0.3%或3%H2O2去離子水（無色液體）孵育10-30分鐘，以滅活內源性過氧化物酶活性。

3）蒸餾水沖洗，PBS浸泡5分鐘

4）候選步驟：采用抗原修復：微波（建議30分鐘內4次中火）、高壓、酶修復方法。自然冷卻，再用3分鐘×3次.

5）血清封閉：室溫15-30分鐘，盡可能與二抗來源一致。傾去，勿洗。

6）滴加適當比例稀釋的一抗，37℃孵育2~3小時或4℃過夜（比較好復溫）。PBS沖洗，3分鐘×5次。

7）滴加生物素標記的二抗，室溫或37℃孵育30分鐘-1h。

8）PBS沖洗，3分鐘×5次。

9）滴加SP（鏈霉親和素-過氧化物酶），室溫或37℃孵育30分鐘-1h。

10）PBS沖洗，3分鐘×5次。

11）顯色劑顯色（DAB等）。

12）自來水充分沖洗。

13）可進行復染，脫水，透明。

14）選擇適當的封片劑封片。 河南免疫組化哪家好英瀚斯生物自有專業病理染色實驗室，可做免疫組化。

免疫組化技術應用于臨床cancer良惡性的判斷，英瀚斯生物為您介紹。對于反應性增生還是cancer性增生，可用免疫球蛋白(Ig)的輕鏈抗體檢測B淋巴細胞增生的單克隆或多克隆性來區別。在濾泡反應性增生時，濾泡反應中心的細胞不表達細胞凋亡蛋白(bcl-2)，bcl-2陰性;而在濾泡性淋巴瘤中，由于90%以上cancer性濾泡細胞有bcl-2的高表達，bcl-2陽性。而增殖細胞核抗原(PCNA)，周期素(Cycling)，核抗原(Ki-67)通過對cancer細胞增生的程度作出評價，從而提示增生細胞的良惡性。

醫療和預后有關的免疫組化。與醫療及預后有關的標記物主要分以下為三類:(1)cancer基因標記物:如cancer基因C-erbB2、c-myc、P53蛋白等，卵巢上皮性cancer中P53的過表達與cancer的擴散、分化、術后殘存cancer灶呈正相關;乳腺cancer中表達C-erbB2的浸潤性cancer患者預后差;肺cancer中突變型P53基因蛋白表達增高，PTEN基因表達減弱，提示cancer預后不良。(2)細胞增殖性標記物:cancer細胞增生是否活躍直接影響著臨床的醫療與預后，如表皮生長因子受體(EGFR)、Ki-67、PCNA、cycling等可對cancer細胞的增生做出評價，表達指數越高，表明其增殖指數越活躍，惡性度增高，預后不良，其中以惡性淋巴瘤乳腺cancer較為明顯;在對乳腺cancer的研究中發現Ki-67、EGFR陽性者，淋巴結轉移率高，并與ji素受體的表達呈負相關。(3)類固醇ji素受體:如雌ji素受體(ER)、孕ji素受體(PR)等，應用更為范圍廣的的是子宮內膜cancer及乳腺cancer，如對乳腺cancer中ER、PR的檢測，有助于決定臨床醫療中是否需要加入內分泌ji素阻斷醫療，并能判斷預后，ER及PR陽性表達、原cancer基因(C-erbB-2)陰性表達病例對三苯氧胺等ji素醫療反應良好，而ERPR、C-erbB-2三種抗體均陰性(TNBC)患者采用三苯氧胺可能意義不大。臨床樣本檢測，免疫組化，英瀚斯生物專業病理。

英瀚斯生物為您整理免疫組化實驗步驟

1、石蠟切片置于65℃烘箱中烘片2h，脫蠟至水，用PBS沖洗三次，每次5min。

2、切片置于EDTA緩沖液中微波修復，中火至沸后斷電，間隔10min低火至沸。

3、自然冷卻后PBS洗3次，每次5min。4、切片放入3%過氧化氫溶液，室溫下孵育10min，以阻斷內源性過氧化物酶。

5、PBS洗3次，每次5min，甩干后5%BSA封閉20min（封閉電荷）。

6、去除BSA液，每張切片加入50μl稀釋的一抗覆蓋組織，4℃過夜。

7、PBS洗3次，每次5min。

8、去除PBS液，每張切片加50μl-100μl相應種屬的二抗，4℃孵育50min。

9、PBS洗3次，每次5min。

10、去除PBS液，每張切片加50-100μl新鮮配制DAB溶液，顯微鏡控制顯色。

11、顯色完全后，蒸餾水或自來水沖洗，蘇木素復染，1%鹽酸酒精分化（1s），自來水沖洗，氨水返藍，流水沖洗。

12、切片經過梯度酒精（70-100%）10min一個梯度，脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封固。 英瀚斯生物，組織包埋、切片、染色、免疫組化拍照、報告分析，一站式搞定！湖北做得好的免疫組化可以做什么

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做免疫組化時如何選擇一抗？

1、單克隆和多克隆抗體的選擇。由一種克隆產生的特異性抗體叫做單克隆抗體。單克隆抗體能目標明確地與單一的特異抗原決定簇結合，就像導彈精確地命中目標一樣。另一方面，即使是同一個抗原決定簇，在機體內也可以由好幾種克隆來產生抗體，形成好幾種單克隆抗體混雜物，稱為多克隆抗體。在抗原抗體反應中，一般單克隆抗體特異性強，但親和力相對小，檢測抗原靈敏度相對就低；而多克隆抗體特異性稍弱，但抗體的親和力強，靈敏度高，但易出現非特異性染色（可以通過封閉等避免）。

2、應用范圍的選擇。有的一抗只能用于Westernblotting，或免疫組化、免疫熒光、免疫沉淀等；甚至標明石蠟切片或冰凍切片。

3、種屬反應性的選擇（speciesreactivity）。這一點很重要，表明這種抗體可能存在種屬差別，且這種抗體適合檢測哪種種屬動物體內的抗原。

4、種屬來源，一般兔來源的多是多克隆抗體；而小鼠來源的多是單克隆抗體，但也有另外。根據此來源來選擇相應的二抗。

5、生產廠家的選擇。

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