免疫組化結(jié)果背景染色較深的原因有哪些？

 （1）抗體濃度過(guò)高：一抗?jié)舛冗^(guò)高是常見的原因之一。解決辦法是，每次使用新抗體前應(yīng)當(dāng)對(duì)其工作濃度進(jìn)行測(cè)試，使每一抗體個(gè)體化，找到適合自己實(shí)驗(yàn)室的理想工作濃度，既使是即用型的抗體也應(yīng)如此，不能只簡(jiǎn)單的按說(shuō)明書進(jìn)行染色。

（2）抗體孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或溫度較高：解決辦法是，嚴(yán)格執(zhí)行操作規(guī)程，比較好隨身佩帶報(bào)時(shí)表或報(bào)時(shí)鐘，及時(shí)提醒，避免因遺忘而造成時(shí)間延長(zhǎng)。現(xiàn)在流行的二步法（Polymer）敏感性很高，要求一抗孵育的時(shí)間不是傳統(tǒng)的1小時(shí)，而是30分鐘，因此，要根據(jù)染色結(jié)果進(jìn)行調(diào)整。 

（3）DAB變質(zhì)和顯色時(shí)間太長(zhǎng)：DAB比較好現(xiàn)用現(xiàn)配，如有沉渣應(yīng)進(jìn)行過(guò)濾后再用。配制好的DAB不應(yīng)存放時(shí)間太長(zhǎng)，因?yàn)樵跊]有酶的情況下，過(guò)氧化氫也會(huì)游離出氧原子與DAB產(chǎn)生反應(yīng)而降低DAB的效力，未用完的DAB存放在冰箱里幾天后再用這種似乎節(jié)約的辦法是不可取的。DAB的顯色比較好在顯微鏡下監(jiān)控，達(dá)到理想的染色程度時(shí)立即終止反應(yīng)。但是當(dāng)染**太多時(shí)或用染色機(jī)時(shí)，這樣做似乎不現(xiàn)實(shí)，但至少應(yīng)對(duì)一些新的或少用的抗體顯色時(shí)進(jìn)行監(jiān)控，避免顯色時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。

英瀚斯專業(yè)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，各類染色、免疫組化、免疫熒光等。 免疫組化檢測(cè)多少錢？安徽靠譜免疫組化哪家好

免疫組化實(shí)驗(yàn)流程介紹：

英瀚斯生物為您整理總結(jié)免疫組化詳細(xì)步驟：

1、SP三步法

1）石蠟切片，常規(guī)脫蠟至水。

2）0.3%或3%H2O2去離子水（無(wú)色液體）孵育10-30分鐘，以滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性。

3）蒸餾水沖洗，PBS浸泡5分鐘

4）候選步驟：采用抗原修復(fù)：微波（建議30分鐘內(nèi)4次中火）、高壓、酶修復(fù)方法。自然冷卻，再用3分鐘×3次.

5）血清封閉：室溫15-30分鐘，盡可能與二抗來(lái)源一致。傾去，勿洗。

6）滴加適當(dāng)比例稀釋的一抗，37℃孵育2~3小時(shí)或4℃過(guò)夜（比較好復(fù)溫）。PBS沖洗，3分鐘×5次。

7）滴加生物素標(biāo)記的二抗，室溫或37℃孵育30分鐘-1h。

8）PBS沖洗，3分鐘×5次。

9）滴加SP（鏈霉親和素-過(guò)氧化物酶），室溫或37℃孵育30分鐘-1h。

10）PBS沖洗，3分鐘×5次。

11）顯色劑顯色（DAB等）。

12）自來(lái)水充分沖洗。

13）可進(jìn)行復(fù)染，脫水，透明。

14）選擇適當(dāng)?shù)姆馄瑒┓馄?河南免疫組化哪家好英瀚斯生物自有專業(yè)病理染色實(shí)驗(yàn)室，可做免疫組化。

免疫組化技術(shù)應(yīng)用于臨床cancer良惡性的判斷，英瀚斯生物為您介紹。對(duì)于反應(yīng)性增生還是cancer性增生，可用免疫球蛋白(Ig)的輕鏈抗體檢測(cè)B淋巴細(xì)胞增生的單克隆或多克隆性來(lái)區(qū)別。在濾泡反應(yīng)性增生時(shí)，濾泡反應(yīng)中心的細(xì)胞不表達(dá)細(xì)胞凋亡蛋白(bcl-2)，bcl-2陰性;而在濾泡性淋巴瘤中，由于90%以上cancer性濾泡細(xì)胞有bcl-2的高表達(dá)，bcl-2陽(yáng)性。而增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)，周期素(Cycling)，核抗原(Ki-67)通過(guò)對(duì)cancer細(xì)胞增生的程度作出評(píng)價(jià)，從而提示增生細(xì)胞的良惡性。

醫(yī)療和預(yù)后有關(guān)的免疫組化。與醫(yī)療及預(yù)后有關(guān)的標(biāo)記物主要分以下為三類:(1)cancer基因標(biāo)記物:如cancer基因C-erbB2、c-myc、P53蛋白等，卵巢上皮性cancer中P53的過(guò)表達(dá)與cancer的擴(kuò)散、分化、術(shù)后殘存cancer灶呈正相關(guān);乳腺cancer中表達(dá)C-erbB2的浸潤(rùn)性cancer患者預(yù)后差;肺cancer中突變型P53基因蛋白表達(dá)增高，PTEN基因表達(dá)減弱，提示cancer預(yù)后不良。(2)細(xì)胞增殖性標(biāo)記物:cancer細(xì)胞增生是否活躍直接影響著臨床的醫(yī)療與預(yù)后，如表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)、Ki-67、PCNA、cycling等可對(duì)cancer細(xì)胞的增生做出評(píng)價(jià)，表達(dá)指數(shù)越高，表明其增殖指數(shù)越活躍，惡性度增高，預(yù)后不良，其中以惡性淋巴瘤乳腺cancer較為明顯;在對(duì)乳腺cancer的研究中發(fā)現(xiàn)Ki-67、EGFR陽(yáng)性者，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率高，并與ji素受體的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。(3)類固醇ji素受體:如雌ji素受體(ER)、孕ji素受體(PR)等，應(yīng)用更為范圍廣的的是子宮內(nèi)膜cancer及乳腺cancer，如對(duì)乳腺cancer中ER、PR的檢測(cè)，有助于決定臨床醫(yī)療中是否需要加入內(nèi)分泌ji素阻斷醫(yī)療，并能判斷預(yù)后，ER及PR陽(yáng)性表達(dá)、原cancer基因(C-erbB-2)陰性表達(dá)病例對(duì)三苯氧胺等ji素醫(yī)療反應(yīng)良好，而ERPR、C-erbB-2三種抗體均陰性(TNBC)患者采用三苯氧胺可能意義不大。臨床樣本檢測(cè)，免疫組化，英瀚斯生物專業(yè)病理。

英瀚斯生物為您整理免疫組化實(shí)驗(yàn)步驟

1、石蠟切片置于65℃烘箱中烘片2h，脫蠟至水，用PBS沖洗三次，每次5min。

2、切片置于EDTA緩沖液中微波修復(fù)，中火至沸后斷電，間隔10min低火至沸。

3、自然冷卻后PBS洗3次，每次5min。4、切片放入3%過(guò)氧化氫溶液，室溫下孵育10min，以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶。

5、PBS洗3次，每次5min，甩干后5%BSA封閉20min（封閉電荷）。

6、去除BSA液，每張切片加入50μl稀釋的一抗覆蓋組織，4℃過(guò)夜。

7、PBS洗3次，每次5min。

8、去除PBS液，每張切片加50μl-100μl相應(yīng)種屬的二抗，4℃孵育50min。

9、PBS洗3次，每次5min。

10、去除PBS液，每張切片加50-100μl新鮮配制DAB溶液，顯微鏡控制顯色。

11、顯色完全后，蒸餾水或自來(lái)水沖洗，蘇木素復(fù)染，1%鹽酸酒精分化（1s），自來(lái)水沖洗，氨水返藍(lán)，流水沖洗。

12、切片經(jīng)過(guò)梯度酒精（70-100%）10min一個(gè)梯度，脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封固。 英瀚斯生物，組織包埋、切片、染色、免疫組化拍照、報(bào)告分析，一站式搞定！湖北做得好的免疫組化可以做什么

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做免疫組化時(shí)如何選擇一抗？

1、單克隆和多克隆抗體的選擇。由一種克隆產(chǎn)生的特異性抗體叫做單克隆抗體。單克隆抗體能目標(biāo)明確地與單一的特異抗原決定簇結(jié)合，就像導(dǎo)彈精確地命中目標(biāo)一樣。另一方面，即使是同一個(gè)抗原決定簇，在機(jī)體內(nèi)也可以由好幾種克隆來(lái)產(chǎn)生抗體，形成好幾種單克隆抗體混雜物，稱為多克隆抗體。在抗原抗體反應(yīng)中，一般單克隆抗體特異性強(qiáng)，但親和力相對(duì)小，檢測(cè)抗原靈敏度相對(duì)就低；而多克隆抗體特異性稍弱，但抗體的親和力強(qiáng)，靈敏度高，但易出現(xiàn)非特異性染色（可以通過(guò)封閉等避免）。

2、應(yīng)用范圍的選擇。有的一抗只能用于Westernblotting，或免疫組化、免疫熒光、免疫沉淀等；甚至標(biāo)明石蠟切片或冰凍切片。

3、種屬反應(yīng)性的選擇（speciesreactivity）。這一點(diǎn)很重要，表明這種抗體可能存在種屬差別，且這種抗體適合檢測(cè)哪種種屬動(dòng)物體內(nèi)的抗原。

4、種屬來(lái)源，一般兔來(lái)源的多是多克隆抗體；而小鼠來(lái)源的多是單克隆抗體，但也有另外。根據(jù)此來(lái)源來(lái)選擇相應(yīng)的二抗。

5、生產(chǎn)廠家的選擇。

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