外泌體的相關(guān)成分：1、外泌體的膜同細(xì)胞一樣，是磷脂雙分子層。2、外泌體膜含有MHC-1/2蛋白，能綁定特異性的肽鏈。3、外泌體膜中有跨膜蛋白PGRL、LAMP1、LAMP2。4、外泌體膜中有膜轉(zhuǎn)運(yùn)融合蛋白annexins、RAN、GTPases。5、外泌體膜上有脂質(zhì)筏Chol、ceramide、SM、PC，限制膜流動(dòng)，參與包括跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、物質(zhì)內(nèi)吞、脂質(zhì)及蛋白定向分選的多種功能。6、外泌體中含有核酸，包括miRNA、DNA、lncRNA、mRNA；同時(shí)還有一些蛋白、脂類也能被包裹到外泌體中。7、與外泌體產(chǎn)生相關(guān)的重要分子：Ral、ARF6、PLD2、RAB家族。8、一些物質(zhì)進(jìn)行外泌體中是特異性的：如hnRNPA2B1能結(jié)合lncRNA或miRNA特異性的序列（GGAG/CCCU），進(jìn)行主動(dòng)包埋。超速離心是目前分離外泌體的主要技術(shù)。外泌體較有用的特性之一是它們穿過(guò)屏障（如細(xì)胞質(zhì)膜和血/腦屏障）的能力。上海宇玫博生物

超速離心是外泌體提取較常用的方法也被認(rèn)為是金標(biāo)準(zhǔn)，主要是根據(jù)外泌體的沉降系數(shù)、大小和形狀將其分離出來(lái)。首先4℃低速離心（300-500g，10min）去除死細(xì)胞以及細(xì)胞碎片，隨后以較高離心速度(2000xg，10min)去除生物聚合物以及凋亡小體，然后用10000xg,30min離心去除大型囊泡，結(jié)尾以超速離心沉淀外泌體。通過(guò)懸浮以及重復(fù)超速離心去除外泌體沉淀中的非外泌體蛋白。超速離心法具有操作簡(jiǎn)單、不易被分離試劑污染、獲得的外泌體數(shù)量較多等優(yōu)點(diǎn)。但是此方法需要昂貴的超高速離心機(jī)，每次處理的樣本量較小，費(fèi)時(shí)，電鏡鑒定時(shí)還發(fā)現(xiàn)外泌體易聚集成塊，且上清中仍能檢測(cè)到大型囊泡，純度不高，另外高速離心會(huì)損傷外泌體影響下游實(shí)驗(yàn)。上海宇玫博生物超速離心法，這是目前外泌體提取較常用的方法。

細(xì)胞外小泡通過(guò)充當(dāng)脂肪組織、肝臟、骨骼肌和免疫細(xì)胞之間的細(xì)胞間通訊方式，在肥胖及其代謝并發(fā)癥的發(fā)展中發(fā)揮作用。外泌體可能在外周胰島素敏感性的調(diào)節(jié)中起作用，外周胰島素敏感性是T2D發(fā)病機(jī)理的主要組成部分。外泌體似乎通過(guò)至少兩種不同的機(jī)制來(lái)調(diào)節(jié)胰島素敏感性，即通過(guò)調(diào)節(jié)炎癥或通過(guò)與胰島素反應(yīng)性部位的直接相互作用。后者可通過(guò)與主要胰島素信號(hào)分子（例如磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/Akt信號(hào)通路）相互作用而影響胰島素信號(hào)通路而直接或間接發(fā)生。與對(duì)照組相比，糖尿病患者的血漿EV含量更高，并且與對(duì)照組相比，糖尿病小鼠的血漿外泌體數(shù)量也更高。然而，確定外泌體的作用及其在肝/腸軸通訊中的潛在作用將需要對(duì)它們的組成有更好的了解，特別是飲食是否會(huì)改變腸源性外泌體的含量，因此就胰島素反應(yīng)而言它們的生物學(xué)功能尚未研究。

外泌體為細(xì)胞療法中的不同合成分子和生物分子的遞送提供了廣闊的前景和嶄新的診療領(lǐng)域。外泌體還顯示出了在診療各種疾?。ㄈ缧募〔『蜕窠?jīng)?。┓矫娴臐摿Α５牵趯?shí)際應(yīng)用外泌體之前，需要使用大型動(dòng)物模型進(jìn)行進(jìn)一步研究和臨床試驗(yàn)。同時(shí)需要開(kāi)發(fā)大規(guī)模生產(chǎn)質(zhì)量可控的外泌體并快速純化外泌體的技術(shù)和策略。另外，在研究和評(píng)估外泌體的副作用和功效時(shí)，必須考慮到肉瘤細(xì)胞來(lái)源的外泌體可能增強(qiáng)肉瘤生長(zhǎng)的潛在風(fēng)險(xiǎn)。外泌體給藥途徑：給藥途徑是獲得所需功效的重要參數(shù)。外泌體可以通過(guò)多種方法給藥，但是，靜脈內(nèi)給藥是較常用的途徑。通過(guò)利用增強(qiáng)通透性和保留（EPR）效應(yīng)，在荷瘤動(dòng)物中靜脈內(nèi)遞送外來(lái)體似乎是有用的。在某些容易達(dá)到肉瘤部位的不同惡性肉瘤中，外泌體療法的給藥途徑是瘤內(nèi)注射。在疾病部位直接注射外泌體的優(yōu)點(diǎn)是可以特異性地運(yùn)送裝載的藥物。另外口服給藥，腹腔給藥，皮內(nèi)給藥和鼻內(nèi)給藥途徑已成功用于外泌體遞送。外泌體鑒定方法從物理特征到表面分子標(biāo)志物，多角度進(jìn)行鑒定。

流式細(xì)胞技術(shù)是細(xì)胞和小顆粒定性和定量表征的有效方法，其用于外泌體定量檢測(cè)的準(zhǔn)確性也在不斷上升。將外泌體表面特異性標(biāo)志物CD63、CD81等相應(yīng)抗體進(jìn)行標(biāo)記，可用流式細(xì)胞儀檢測(cè)到陽(yáng)性表達(dá)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)外泌體的定量。但流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)時(shí)需要單顆粒懸浮液，當(dāng)外泌體濃度高或分離過(guò)程中發(fā)生外泌體囊泡聚集時(shí)將導(dǎo)致一次觀察到多個(gè)顆粒，從而導(dǎo)致數(shù)據(jù)不準(zhǔn)確。因此，為了通過(guò)流式細(xì)胞儀觀察，需要將外泌體通過(guò)免疫捕獲或共價(jià)結(jié)合固定在磁珠表面上，從而便于將外泌體囊泡暴露于已知或者預(yù)期在外泌體表面表達(dá)的抗原的熒光偶聯(lián)抗體中。在流式細(xì)胞術(shù)之前，可以在落射熒光顯微鏡（EPI）下觀察與磁珠和熒光抗體偶聯(lián)的外泌體囊泡。當(dāng)樣品通過(guò)流式細(xì)胞儀時(shí)采集熒光信號(hào)，不只可以對(duì)外泌體進(jìn)行高通量分析，還可以基于抗原表達(dá)對(duì)外泌體進(jìn)行定量或分類。外泌體中常見(jiàn)的細(xì)胞質(zhì)蛋白是Rabs蛋白，是鳥(niǎo)苷酸三磷酸酶家族的一種。外泌體可通過(guò)其攜帶的蛋白質(zhì)、核酸、脂類等來(lái)調(diào)節(jié)受體細(xì)胞的生物學(xué)活性。上海宇玫博生物

近年來(lái)，隨著外泌體研究的不斷深入，它的應(yīng)用已經(jīng)涉及醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)和免疫領(lǐng)域、寄生蟲(chóng)領(lǐng)域。上海宇玫博生物

磁珠免疫法分離外泌體：將針對(duì)目的抗原的抗體通過(guò)生物素-鏈霉親和素連接到磁珠表面，然后將磁珠與樣品共孵育，使外泌體特異性結(jié)合到磁珠上形成磁珠-外泌體復(fù)合物，再用蒸餾水或者PBS沖洗，結(jié)尾用甘氨酸-Tris-HCl溶液洗脫獲得外泌體。該方法相對(duì)于ELISA的好處主要是，珠粒提供了更大的表面積來(lái)捕獲外泌體，從而提高了分離效率。此外，使用磁珠時(shí)，樣品起始體積沒(méi)有上限，而基于微孔板的ELISA分析的較大樣品體積為100μL，且ELISA洗脫雜質(zhì)時(shí)容易造成孔間交叉污染。當(dāng)將磁珠法與金標(biāo)準(zhǔn)外泌體分離方法進(jìn)行比較時(shí)，磁珠法可分離出更純凈的外泌體，特異性高、速度更快，并且不需要昂貴的儀器。另外，與其他分離方法（如超速離心或超濾）相比，磁珠法不影響外泌體形態(tài)。但是采用磁珠法時(shí)，外泌體生物活性易受PH和鹽濃度影響。上海宇玫博生物

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