外泌體研究背景：胞外囊泡是從細胞膜上脫落或者由細胞分泌的具有雙層膜結構的囊泡狀小體，主要由微囊泡、凋亡小體、外泌體組成。而外泌體是其中一類小囊泡，直徑為30~150nm，密度1.10~1.18g/ml，可攜帶核酸、蛋白質質和脂質等，存在于血液、唾液、尿液等多種體液中。越來越多的研究證實，外泌體可以通過細胞間轉移核酸、蛋白質、脂質等特定物質，發揮特殊的功能。如在抗原提呈細胞中呈遞抗原程中、肉瘤細胞發生了發展、神經細胞信號轉導過程中都發揮著重要作用。對外泌體的分析和檢測可以輔助疾病的早期診斷、療效評價和預后分析。對外泌體的分析和檢測可以輔助疾病的早期診斷、療效評價和預后分析。外泌體免疫熒光標記

外泌體的相關成分：1、外泌體的膜同細胞一樣，是磷脂雙分子層。2、外泌體膜含有MHC-1/2蛋白，能綁定特異性的肽鏈。3、外泌體膜中有跨膜蛋白PGRL、LAMP1、LAMP2。4、外泌體膜中有膜轉運融合蛋白annexins、RAN、GTPases。5、外泌體膜上有脂質筏Chol、ceramide、SM、PC，限制膜流動，參與包括跨膜信號轉導、物質內吞、脂質及蛋白定向分選的多種功能。6、外泌體中含有核酸，包括miRNA、DNA、lncRNA、mRNA；同時還有一些蛋白、脂類也能被包裹到外泌體中。7、與外泌體產生相關的重要分子：Ral、ARF6、PLD2、RAB家族。8、一些物質進行外泌體中是特異性的：如hnRNPA2B1能結合lncRNA或miRNA特異性的序列（GGAG/CCCU），進行主動包埋。外泌體的膜同細胞一樣，是磷脂雙分子層。外泌體免疫熒光標記人體內多種細胞及體液均可分泌外泌體，包括內皮細胞、免疫細胞、血小板、平滑肌細胞等。

透射電子顯微鏡（TEM）和掃描電子顯微鏡（SEM）是用于評估外泌體形態、大小和表型的的兩種常見的電子顯微鏡。SEM和TEM均使用電子束產生高分辨率的亞微米顆粒放大圖像，以區分外泌體與殘留在樣品中相似大小的非外泌體顆粒，該方法還可用于檢查樣品的純度。TEM與SEM之間的區別在于檢測電子類別，在SEM中，電子與樣品中的粒子相互作用時會發生散射，捕獲并檢測散射的電子，從而生成粒子圖像。但是，在TEM中，不與粒子相互作用的電子穿過樣品，并使用熒光屏進行檢測。電子顯微鏡下外泌體大小不一，通常呈茶托樣的圓形或橢圓形。采用電子顯微鏡檢測外泌體時對樣品的預處理和制備要求較高，外泌體的提取方法和品質會對電鏡結果造成影響；另外樣品的準備階段比較復雜，不適合進行大量快速的測量；而且由于樣本經過了干燥、固定以及冷凍等預處理和制備過程，對生物樣本的結構會造成一定的破壞，從而影響觀察的效果，無法準確測量外泌體濃度。

外泌體的提取主要包括以下幾種方式。一是超速離心法，這是目前外泌體提取較常用的方法。此種方法得到的外泌體量多，但是純度不足，電鏡鑒定時發現外泌體聚集成塊，由于微泡和外泌體沒有非常統一的鑒定標準，也有一些研究認為此種方法得到的是微泡不是外泌體。二是過濾離心，這種操作簡單、省時，不影響外泌體的生物活性，但同樣存在純度不足的問題。三是密度梯度離心法，用此種方法分離到的外泌體純度高，但是前期準備工作繁雜，耗時，量少。膜受體的識別是外泌體細胞反應的基礎，它可能活躍受體并隨后導致相關信號通路的活躍。NTA技術已被作為外泌體表征手段之一。

外泌體的提取分離方法：1、PEG-base沉淀法：聚乙二醇可與疏水性蛋白和脂質分子結合共沉淀，早先應用于從血清等樣本中收集病毒，現在也被用來沉淀外泌體，其原理可能與競爭性結合游離水分子有關。利用PEG沉淀外泌體存在不少問題：比如純度和回收率低，雜蛋白較多（假陽性），顆粒大小不均一，產生難以去除的聚合物，機械力或者吐溫-20等化學添加物將會破壞外泌體等，因此發表文章時易受質疑。2、試劑盒提取：近幾年來，市場上已出現各種商業化的外泌體提取試劑盒，有的是通過特殊設計的過濾器過濾掉雜質成分，有的則采用空間排阻色譜法(SEC)進行分離純化，也有的則利用化合物沉淀將法外泌體沉淀出來。外泌體可以將PD-L1轉運至其他PD-L1表達低或沒有PD-L1的細胞，并可能與PD-1結合。外泌體免疫熒光標記

外泌體是細胞分泌的納米級膜微粒,能在細胞與細胞之間傳遞信息。外泌體免疫熒光標記

超速離心是外泌體提取較常用的方法也被認為是金標準，主要是根據外泌體的沉降系數、大小和形狀將其分離出來。首先4℃低速離心（300-500g，10min）去除死細胞以及細胞碎片，隨后以較高離心速度(2000xg，10min)去除生物聚合物以及凋亡小體，然后用10000xg,30min離心去除大型囊泡，結尾以超速離心沉淀外泌體。通過懸浮以及重復超速離心去除外泌體沉淀中的非外泌體蛋白。超速離心法具有操作簡單、不易被分離試劑污染、獲得的外泌體數量較多等優點。但是此方法需要昂貴的超高速離心機，每次處理的樣本量較小，費時，電鏡鑒定時還發現外泌體易聚集成塊，且上清中仍能檢測到大型囊泡，純度不高，另外高速離心會損傷外泌體影響下游實驗。外泌體免疫熒光標記

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