聚合酶鏈反應(yīng)同時擴(kuò)增單個精子中幾個基因座的能力]增強了極大地增強了通過研究減數(shù)分裂后染色體交叉來進(jìn)行基因定位的傳統(tǒng)任務(wù)。通過分析數(shù)千個單個精子,已經(jīng)直接觀察到非常緊密基因座之間罕見的交叉事件。類似地,可以分析異常的缺失、插入、易位或倒位,所有這些都無需等待(或支付)漫長而艱苦的受精、胚胎發(fā)生等過程。定點突變:聚合酶鏈反應(yīng)可用于產(chǎn)生突變基因,突變由科學(xué)家隨意選擇。可以選擇這些突變來理解蛋白質(zhì)是如何完成其功能的,并改變或改善蛋白質(zhì)功能。重疊延伸聚合酶鏈反應(yīng):一種用于將兩個或多個含有互補序列的DN段拼接在一起的基因工程技術(shù)。南通分子生物學(xué)Real-time PCR
絕大多數(shù)聚合酶鏈反應(yīng)方法依賴于熱循環(huán)。熱循環(huán)將反應(yīng)物暴露于加熱和冷卻的重復(fù)循環(huán)中,以允許不同的溫度依賴性反應(yīng)——具體地說,脫氧核糖核酸融化和酶-驅(qū)動DNA復(fù)制。聚合酶鏈反應(yīng)使用兩種主要試劑-引物(引物是短的單鏈DN段,稱為寡核苷酸,是目標(biāo)DNA區(qū)域的互補序列)和DNA聚合酶。在PCR反應(yīng)的步,DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的兩條鏈在高溫下物理分離,這個過程稱為脫氧核糖核酸變性。第二步,降低溫度,引物與互補的脫氧核糖核酸序列結(jié)合。這兩條DNA鏈就變成了模板,以酶促的方式從構(gòu)成DNA的自由核苷酸中組裝出一條新的DNA鏈。隨著聚合酶鏈反應(yīng)的進(jìn)行,產(chǎn)生的DNA本身被用作復(fù)制的模板,啟動了一個連鎖反應(yīng),原始的DNA模板是以指數(shù)形式放大。南通分子生物學(xué)Real-time PCR重疊延伸聚合酶鏈反應(yīng)用于連接含有基因、調(diào)節(jié)序列或突變的DN段。
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng):DNA的半保留復(fù)制是生物進(jìn)化和傳代的重要途徑。雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解旋成單鏈,在DNA聚合酶的參與下,根據(jù)堿基互補配對原則復(fù)制成同樣的兩分子拷貝。在實驗中發(fā)現(xiàn),DNA在高溫時也可以發(fā)生變性解鏈,當(dāng)溫度降低后又可以復(fù)性成為雙鏈。因此,通過溫度變化控制DNA的變性和復(fù)性,加入設(shè)計引物,DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的體外復(fù)制。但是,DNA聚合酶在高溫時會失活,因此,每次循環(huán)都得加入新的DNA聚合酶,不但操作煩瑣,而且價格昂貴,制約了PCR技術(shù)的應(yīng)用和發(fā)展。耐熱DNA聚合酶-Taq酶的發(fā)現(xiàn)對于PCR的應(yīng)用有里程碑的意義,該酶可以耐受90℃以上的高溫而不失活,不需要每個循環(huán)加酶,使PCR技術(shù)變得非常簡捷、同時也降低了成本,PCR技術(shù)得以大量應(yīng)用,并逐步應(yīng)用于臨床。
聚合酶鏈反應(yīng):熱啟動聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng):一種在PCR的初始建立階段減少非特異性擴(kuò)增的技術(shù)。它可以通過將反應(yīng)組分加熱到變性溫度(例如95 c)在加入聚合酶。[36]已經(jīng)開發(fā)了特殊的酶系統(tǒng),通過結(jié)合抗體來抑制聚合酶在環(huán)境溫度下的活性[37][37]或者通過共價鍵結(jié)合的抑制劑的存在,該抑制劑在高溫活化步驟后解離。熱啟動/冷完成聚合酶鏈反應(yīng)是通過新的雜合聚合酶實現(xiàn)的,這些酶在環(huán)境溫度下不活躍,在伸長溫度下立即。序列間特異性聚合酶鏈反應(yīng)(ISSR):一種用于DNA指紋識別的聚合酶鏈反應(yīng)方法,它放大簡單重復(fù)序列之間的區(qū)域,以產(chǎn)生擴(kuò)增片段長度的獨特指紋。電子聚合酶鏈反應(yīng)(數(shù)字聚合酶鏈反應(yīng)、虛擬聚合酶鏈反應(yīng)、電子聚合酶鏈反應(yīng)、電子聚合酶鏈反應(yīng))是指計算工具使用給定的一組引物 ( 探針)來擴(kuò)增來自測序的基因組或轉(zhuǎn)錄組的DNA 序列,用于計算理論聚合酶鏈反應(yīng)結(jié)果。電子PCR被提出作為分子生物學(xué)的教育工具。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的引物與模板的結(jié)合及引物鏈的延伸是遵循堿基配對原則的。
PCR的反應(yīng)條件:Tm=4(G+c)+(A+T),一般在45~55度,溫度低容易退火但特異性低;溫度高,不容易退火但特異性高。退火時間30秒。延伸溫度一般在70~75度這時TaqDNA聚合酶活性很高(150個/S),當(dāng)引物在16個堿基以下時可采用緩慢升高溫度到70~75度的方法,使在低溫下就開始合成。一般<1KB時間1分鐘即可。當(dāng)〈1KB時在較后的循環(huán)中延長擴(kuò)增時間。循環(huán)次數(shù)25~30次。無產(chǎn)物時:取10ul擴(kuò)增混合液作模板在進(jìn)行PCR擴(kuò)增;增加TaqDNA聚合酶濃度;增加循環(huán)次數(shù);降低退火溫度;加靶DNA量。像所有酶一樣,DNA聚合酶也容易出錯,這反過來會導(dǎo)致產(chǎn)生的PCR片段發(fā)生突變。南通分子生物學(xué)Real-time PCR
聚合酶鏈反應(yīng)應(yīng)經(jīng)常使用帶有一次性柱塞和超長移液器吸頭的移液器。南通分子生物學(xué)Real-time PCR
聚合酶鏈反應(yīng)的常見問題分析與解決方法:擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)多條帶(雜帶):引物用量偏大,引物的特異性不高。應(yīng)調(diào)換引物或降低引物的使用量。循環(huán)的次數(shù)過多。適當(dāng)增加模板的量,減少循環(huán)次數(shù)。酶的用量偏高或酶的質(zhì)量不好,應(yīng)降低酶量或調(diào)換另一來源的酶。退火溫度偏低,退火及延伸時間偏長。應(yīng)提高退火溫度,減少變性與延伸時間,也可采用二種溫度的PCR擴(kuò)增。以2度為梯度設(shè)計梯度PCR反應(yīng)優(yōu)化退火溫度。 樣品處理不當(dāng)。Mg2+濃度偏高,因適當(dāng)調(diào)整Mg2+使用濃度。若為PCR試劑盒,也可能時試劑盒本身質(zhì)量有問題。復(fù)制提前終止。使用非熱啟動的聚合酶時常有發(fā)生。冰上準(zhǔn)備反應(yīng)體系或采用熱啟動聚合酶。南通分子生物學(xué)Real-time PCR
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