當(dāng)外泌體在1980年初次被發(fā)現(xiàn)后,其被認(rèn)為是細胞排泄廢物的一種方式,如今隨著大量對其生物來源、其物質(zhì)構(gòu)成及運輸、細胞間信號的傳導(dǎo)以及在體液中的分布的研究發(fā)現(xiàn)外泌體具有多種多樣的功能。外泌體的功能取決于其所來源的細胞類型,其可參與到機體免疫應(yīng)答、抗原提呈、細胞遷移、細胞分化、肉瘤侵襲等方方面面。有研究表明肉瘤來源的外泌體參與到肉瘤細胞與基底細胞的遺傳信息的交換,從而導(dǎo)致大量新生血管的生成,促進了肉瘤的生長與侵襲。外泌體具有相似布朗運動的蛋白質(zhì)聚集體,因此無法排除其他物質(zhì)干擾。血漿外泌體質(zhì)譜
外泌體的相關(guān)成分:1、外泌體的膜同細胞一樣,是磷脂雙分子層。2、外泌體膜含有MHC-1/2蛋白,能綁定特異性的肽鏈。3、外泌體膜中有跨膜蛋白PGRL、LAMP1、LAMP2。4、外泌體膜中有膜轉(zhuǎn)運融合蛋白annexins、RAN、GTPases。5、外泌體膜上有脂質(zhì)筏Chol、ceramide、SM、PC,限制膜流動,參與包括跨膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、物質(zhì)內(nèi)吞、脂質(zhì)及蛋白定向分選的多種功能。6、外泌體中含有核酸,包括miRNA、DNA、lncRNA、mRNA;同時還有一些蛋白、脂類也能被包裹到外泌體中。7、與外泌體產(chǎn)生相關(guān)的重要分子:Ral、ARF6、PLD2、RAB家族。8、一些物質(zhì)進行外泌體中是特異性的:如hnRNPA2B1能結(jié)合lncRNA或miRNA特異性的序列(GGAG/CCCU),進行主動包埋。血漿外泌體質(zhì)譜外泌體可以包含不同類型的細胞表面蛋白、細胞內(nèi)蛋白、RNA、DNA、氨基酸和代謝物。
外泌體的提取主要包括以下幾種方式:1、免疫磁珠法,這種方法可以保證外泌體形態(tài)的完整,特異性高、操作簡單、不需要昂貴的儀器設(shè)備,但是非中性pH和非生理性鹽濃度會影響外泌體生物活性,不便進行下一步的實驗。2、PS親和法,該方法將PS(磷脂酰絲氨酸)與磁珠結(jié)合,利用親和原理捕獲外泌體囊泡外的PS。該方法與免疫磁珠法相似,獲得的外泌體形態(tài)完整,純度較高。由于不使用變性劑,不影響外泌體的生物活性,外泌體可用于細胞共培養(yǎng)和體內(nèi)注射。3、色譜法,這種方法分離到的外泌體在電鏡下大小均一,但是需要特殊的設(shè)備,應(yīng)用不普遍。
流式細胞技術(shù)是細胞和小顆粒定性和定量表征的有效方法,其用于外泌體定量檢測的準(zhǔn)確性也在不斷上升。將外泌體表面特異性標(biāo)志物CD63、CD81等相應(yīng)抗體進行標(biāo)記,可用流式細胞儀檢測到陽性表達,從而實現(xiàn)對外泌體的定量。但流式細胞技術(shù)檢測時需要單顆粒懸浮液,當(dāng)外泌體濃度高或分離過程中發(fā)生外泌體囊泡聚集時將導(dǎo)致一次觀察到多個顆粒,從而導(dǎo)致數(shù)據(jù)不準(zhǔn)確。因此,為了通過流式細胞儀觀察,需要將外泌體通過免疫捕獲或共價結(jié)合固定在磁珠表面上,從而便于將外泌體囊泡暴露于已知或者預(yù)期在外泌體表面表達的抗原的熒光偶聯(lián)抗體中。在流式細胞術(shù)之前,可以在落射熒光顯微鏡(EPI)下觀察與磁珠和熒光抗體偶聯(lián)的外泌體囊泡。當(dāng)樣品通過流式細胞儀時采集熒光信號,不只可以對外泌體進行高通量分析,還可以基于抗原表達對外泌體進行定量或分類。外泌體中常見的細胞質(zhì)蛋白是Rabs蛋白,是鳥苷酸三磷酸酶家族的一種。近年來,隨著外泌體研究的不斷深入,它的應(yīng)用已經(jīng)涉及醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)和免疫領(lǐng)域、寄生蟲領(lǐng)域。
外泌體的生物發(fā)生和鑒定。液體和細胞外成分,如蛋白質(zhì)、脂類、代謝物、小分子和離子,可以通過內(nèi)吞作用和質(zhì)膜內(nèi)陷,與細胞表面蛋白一起進入細胞。由此產(chǎn)生的胞腔側(cè)質(zhì)膜芽的形成表現(xiàn)為質(zhì)膜的外-內(nèi)取向。這一出芽過程導(dǎo)致芽的形成可能與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、跨高爾基網(wǎng)絡(luò)(TGN)和線粒體預(yù)先形成的早期核內(nèi)體融合。ESEs也可以與ER和TGN融合,這可能解釋了內(nèi)吞物如何到達它們的。因此,一些ESEs可以包含膜和腔的成分,可以表示不同的起源。外泌體表面蛋白包括四聚體蛋白、整合蛋白、免疫調(diào)節(jié)蛋白等。外泌體可以包含不同類型的細胞表面蛋白、細胞內(nèi)蛋白、RNA、DNA、氨基酸和代謝物。流式細胞技術(shù)是細胞和小顆粒定性和定量表征的有效方法,其用于外泌體定量檢測的準(zhǔn)確性也在不斷上升。血漿外泌體質(zhì)譜
外泌體為細胞療法中的不同合成分子和生物分子的遞送提供了廣闊的前景和嶄新的診療領(lǐng)域。血漿外泌體質(zhì)譜
外泌體的提取主要包括以下幾種方式。一是超速離心法,這是目前外泌體提取較常用的方法。此種方法得到的外泌體量多,但是純度不足,電鏡鑒定時發(fā)現(xiàn)外泌體聚集成塊,由于微泡和外泌體沒有非常統(tǒng)一的鑒定標(biāo)準(zhǔn),也有一些研究認(rèn)為此種方法得到的是微泡不是外泌體。二是過濾離心,這種操作簡單、省時,不影響外泌體的生物活性,但同樣存在純度不足的問題。三是密度梯度離心法,用此種方法分離到的外泌體純度高,但是前期準(zhǔn)備工作繁雜,耗時,量少。膜受體的識別是外泌體細胞反應(yīng)的基礎(chǔ),它可能活躍受體并隨后導(dǎo)致相關(guān)信號通路的活躍。血漿外泌體質(zhì)譜
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